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《生物技术大实验》实验指导书--重庆邮电学院

《生物技术大实验》实验指导书
生物技术教学部 常平安 舒坤贤 谢永芳 编

重庆邮电学院生物信息学院 2005 年 3 月 1 日





《生物技术大实验》是为生物技术专业本科高年级学生开设的综合实验课程,是在 普通生物学实验、生物化学实验、微生物实验、细胞生物学和遗传学实验的基础上的综 合实验课程。该实验课程偏重于分子生物学实验教学,通过此实验课程,学生不仅学习 到最基本的分子生物学技术,而且学习到前沿的生物技术。 分子生物学实验技术突飞猛进,日新月异。分子生物学技术的广泛应用,在 20 世 纪下半叶对生命科学的进步产生了举世公认的巨大推动作用, 而且对人们的生活和整个 社会的发展亦产生了巨大的冲击和影响。分子生物学技术已广泛渗透和应用到生物学、 遗传学、细胞学、微生物学、进化学、肿瘤学、免疫学、药理学、发育学、病毒学、神 经生物学、生药学、法医学等与基础医学和临床医学有关的研究领域。21 世纪将更是分 子生物学技术快速发展的时期, 由此引起的生物技术革命并将更加深刻地影响社会的发 展。 学生基本技能和动手能力的培养都离不开实验室,离不开实验课上的训练,很多理 论上的原理都需要到实验课上去验证,很多理论上的知识都需要到实验课上去实践。而 实验课教材或实验指导书是开好实验课的基本条件之一。 虽然目前的分子生物学实验 教材版本众多,但针对本科生的生物技术大实验教材尚无出版。为了加强本学科的教材 建设,促进本学科实验课的开设,我们参考了国内外最新的有关分子生物学实验技术的 专著,根据我校学生的特点及我们自己现有的基础和条件,特选择了部分实验内容,并 结合我们的经验与体会,汇编成了生物技术大实验实验指导书,以供参考。在使用过程 中, 可根据不同的层次适当增减。 同时, 对于新近产生和应用前景广阔的生物芯片技术、 RNAi 技术和蛋白质组研究等,限于我们目前的条件,只能作些演示或作为动态给以介 绍,条件一经成熟,即行开设。 由于分子生物学技术和生物技术的快速发展,加之我们是第一次这样系统地给学生 开设生物技术大试验课程, 许多工作还处于不断探索的过程中, 难免有不妥和疏漏之处, 恳切期望读者提出宝贵意见,以利不断修正完善。 编 者

2005 年 3 月

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实验一 质粒的提取和纯化 ……………………………………………. 3 实验二 质粒 DNA 的电泳和纯度检测…………….……………………..6 实验三 PCR 产物的 TA 克隆……………………………………………...9 实验四 感受态大肠杆菌细胞的制备…………………………………...12 实验五 重组 DNA 转化大肠杆菌…………………………………........12 实验六 PCR 扩增基因特异片段………………………………………..15 实验七 DNA 片段的回收及纯化………………………………………..19 实验八 PCR 法快速鉴定重组载体……………………………………...22 实验九 限制性内切酶酶切法鉴定重组质粒…………………………...24 实验十 外源基因在大肠杆菌中的表达及其检测……………………….28 实验十一 RNA 的提取及其纯度检测……………………………………32 实验十二 逆转录 PCR (RT-PCR) 扩增基因特异片段…………………..35 实验十三 DNA 探针制备……………………………………………..…38 实验十四 Southern 印迹杂交……………………………………………41 实验十五 Northern 印迹杂交……………………………………………44 实验十六 荧光原位杂交(FISH)技术…………………………………47 实验十七 外源基因在哺乳细胞中的表达及其检测…………………...50 实验十八 生物芯片技术………………………………………………...53 实验十九 RNAi 技术……………………………………………………56 实验二十 蛋白质组技术………………………………………………...58 附录 基因工程基本技术路线…………………………………………….60

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实验一 质粒的提取和纯化 实验目的:了解碱裂解法制备质粒的原理,掌握质粒的小量制备方法。 实验原理:质粒 DNA 的抽提是基因工程操作中最常用与最基本的技术,现已有多种成熟
的方案可供选择。最常用的有利用碱性条件下质粒 DNA 与染色体 DNA 变复性的不同进行分离的碱 法;利用酸性、低离子强度时超螺旋在水相中,开环、线型分子在酚相中进行分离的酸酚法;利用 羟基磷灰石在特定的条件下(8mol/L 尿素,0.24mol/L 磷酸缓冲液 pH=6.8)只吸附双链 DNA 的羟 基磷灰石法(在上述条件下染色体 DNA 均成单链,质粒 DNA 保持双链)等。本实验选做的是碱法。 1. 裂解细胞 裂解细胞是指通过溶菌酶、去污剂等试剂破裂细胞壁与膜的过程。对于不同的菌

要选用不同的方法,通常有煮沸法、非离子型去污剂法、碱性 SDS 法(简称碱法)等。三种方法比较 而言,非离子型去污剂法较温和,适用于抽提 10kb 左右的质粒;而煮沸法与碱性 SDS 法相对较剧 烈,只能抽提小于 10kb 的质粒。常用的离子型去污剂是 SDS、非离子型去污剂有 Triton X-100 等。 2.分离 即将质粒 DNA 和染色体 DNA 分离。碱法的分离原理如下:大肠杆菌的染色体约有 4700kb 长,在处理细胞过程中都断裂成不同长度的双链 DNA 片段。当溶液的 pH 调到大于 12 时双 链 DNA 中的氢键被破坏,于是染色体 DNA 的双链分离成单链;而超螺旋状态的质粒 DNA 仅仅是 氢键被破坏,并只发生部分双链解离成单链的变化。再当 pH 调回中性时单链 DNA 互相缠绕且与蛋 白质结合生成网络状大分子,而超螺旋的质粒发生复性反应后仍是小分子,通过离心的方法很容易 将二者分开,达到分离的目的。 3.纯化 细胞裂解液中的杂质除了染色体 DNA 外还有各种细胞壁、膜碎片、蛋白质、脂质类 物质及 RNA。纯化的步骤就是有针对性地将它们去除。RNA 可用牛胰 Rnase A 分解除去。蛋白质可 通过酚、酚/氯仿、氯仿/异戊醇,使蛋白质变性剂而除去,同时,氯仿有强烈的溶脂倾向,对于 在除去蛋白质的同时去除脂质类杂质很有好处。氯仿还能将微量的、溶于 DNA 水溶液的酚抽提掉, 而微量的酚对于以后的酶切、转化等过程都会产生不利影响。氯仿/异戊醇的蛋白质变性能力较弱, 主要用于含酚试剂处理后的抽提。 正确的去除蛋白质杂质的过程应该是酚一酚+氯仿((1:1))一氯仿(或氯仿/异戊醇 24:1),处 理,根据实验情况也可考虑省略第一或第二步,但切记不可将氯仿(氯仿/异戊醇)的处理步骤省 略掉。抽提过程完成后的水溶液中仍有痕量的酚、氯仿等,可用乙醇沉淀的方法将它们除去。用无 水乙醇沉淀的特点是能将 DNA 进行浓缩, 且同时也更换了整个缓冲系统, DNA 也有一定的损失。 但

实验内容:
试剂
1.LB 培养液(1L) 细菌培养用蛋白胨 细菌培养用酵母粉 10g 5g
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NaCl 10g 用 10mol/L NaOH 调至 pH7.0,高压蒸气灭菌, 4℃贮存. 2.溶液Ⅰ,可成批配臵,灭菌后 4℃贮存。 葡萄糖 Tris-C1(pH8.0) EDTA 3.溶液Ⅱ(新鲜配制) NaOH SDS 0.2mol/L 1% 5mol/L KAc 冰醋酸 水 60ml 11.5ml 28.5ml 50mmol/L 25mmol/L 10mmol/L

4.溶液Ⅲ

配制好的溶液Ⅲ含 3mol/L 钾盐,5mol/L 醋酸(pH4.8) 卡那霉素(Kana): 50mg/ml, 过滤除菌. 5. 重蒸酚 市售苯酚蒸馏纯化(收集 179~181℃之间的酚)后, TE 饱和, 用 使水相的 pH 在 7.5 以上, 4℃保存。 6.氯仿 异戊醇(24:1) 7.无水乙醇 8.RNaseA(10mg/ml) 9.3mol/L NaAc(pH5.2) 10.TE 10mmol/L Tris-C1(pH8.0) 1mmoI/L EDTA

材料
含有质粒(pNTE-EGFP, pEGFPN3)的大肠杆菌 DH5a.

操作步骤
1.挑取琼脂培养板上的含有 pNTE-EGFP, pEGFPN3 质粒的单菌落,接种至 5ml LB 培养液(含 Kana 50μg/m1),37℃振荡培养过夜。 2.取出 1.5ml 培养液至 1.5ml 离心管中,12 000r/min 离心 2min,弃上清。 3.将细菌沉淀重悬于 100μl 预冷的溶液工中,强烈振荡混匀。 4.加入 200μl 溶液Ⅱ,盖严管盖,轻轻颠倒混匀 5 次,冰浴 5min。 5.加入 150μl 预冷的溶液Ⅲ,温和振荡 10s,冰浴 5min。 6.12 000r/min 室温离心 5min,取上清至一个新的无菌的 1.5m1 Eppendorf 管中。 7. 加入等体积酚/氯仿(1:1), 振荡混匀, 000r/min 离心 2min, 12 上清转移至另一个 Eppendorf 管中。 【注意】酚具有腐蚀性,操作时小心。 8.加人等体积氯仿,振荡混匀,12 000r/min 离心 2min,上清转移至另一个 Eppendorf 管中。 10.加入 2 倍体积预冷无水乙醇-20℃沉淀 10min。 11.12 000r/min 离心 10min,去上清,沉淀用 70%乙醇洗涤一次,空气中晾干。 12.加入 20μl TE 溶解质粒 DNA,加入 RNaseA,终浓度 20μg/m1 37℃水浴 0.5h。
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13 经 0.7%琼脂糖凝胶电泳,EB 染色后观察抽提结果。 【注意】EB 为致癌物,操作时一定要戴乳 胶或一次性手套。 14.将该管质粒保存于-20℃备用。

注意事项
1.该实验成功的标志是把染色体 DNA、蛋白质与 RNA 去除干净,获得一定得率的质粒 DNA。 去掉染色体 DNA 最为重要,也较困难,因为在全部提取过程中,只有一次机会去除染色体 DNA, 其关键步骤是加入溶液Ⅱ与溶液Ⅲ时, 控制变性与复性操作时机, 既要使试剂与染色体 DNA 充分作 用使之变性,又要使染色体 DNA 不断裂解成小片段,从而能与质粒 DNA 相分离。这就要求试剂与 溶菌液充分摇匀,摇动时用力适当,一般来说当溶液Ⅰ加入时可用力振荡几次,因为此时细菌还没 有与碱和 SDS 作用,染色体 DNA 尚未释放,不必担心其分子断裂,加入 SDS 后,则要注意不能过 分用力振荡,温和混匀,但又必须让它反应充分。加入溶液 II 混匀之后,一定在冰上放臵,不要摇动,对 于溶液溶液 III,同样处理! 2. 加入溶液 I 之前,注意将离心管倒扣过来,将培养基完全流出. 2.加乙醇沉淀 DNA 时,要把离心管加盖倒翻摇动 4~5 次,注意观察水相与乙醇之间没有分层现 象之后,才可以放在冰箱中去沉淀 DNA,以获得更多的 DNA。 3.乙醇沉淀 DNA 离心后,要把离心管四周的上清液抽干或自然挥发(可将离心管倒臵于滤纸上以 尽量让管内液体流出)。否则,用 TE 缓冲液溶解 DNA 时,既困难又不完全。 4. 为了得到纯净的 DNA 样品和清晰的电泳条带, 加入 1μl RNA 酶, 将管臵 50℃水浴箱内 30min, 消化 RNA。 6.抽提产物经电泳分离、EB 染色后,在紫外线灯下可观察到三个条带,自前往后分别为:超螺 旋、线性及开环质粒 DNA。

【思考题】 碱法提取质粒的原理是什么? 【课外阅读】 高纯度质粒 DNA 的提取,参阅 Qiagen 公司说明书,网站:www.qiagen.com

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实验二 质粒 DNA 的电泳和纯度检测 实验目的:掌握 DNA 琼脂糖电泳技术,了解紫外分光光度法测定 DNA 浓度和纯度的原
理。

实验原理: 带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。其中,凝胶电泳由于其操作简单、
快速、灵敏等优点,使它成为分离、鉴定和提纯核酸的首选标准方法。 与蛋白质分子类似,核酸分子也是两性解离分子。在 pH3.5 时,碱基上的氨基基团解离,而三 个磷酸基团中只有第一个磷酸解离,整个分子带正电荷,在电场中向负极泳动;在 pH 值为 8.0~8.3 时,碱基几乎不解离,磷酸全部解离,核酸分子带负电荷,向正极移动。不同大小和构象的核酸分 子的电荷密度大致相同,在自由泳动时,各核酸分子的迁移率区别很小,难以分开。所以采用适应 浓度的凝胶介质作为电泳支持物,发挥分子筛的功能,使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率 出现较大差异,达到分离的目的。值得注意的是,等长度的单链 DNA 和双链 DNA 在中性或碱性凝 胶中的迁移率大致相等。 1.影响泳动的四大因素 (1)影响泳动的首要因素是电泳样品的物理性质:包括电荷多少、分子大小、颗粒形状和空间结 构。一般来说颗粒带电荷的密度愈大,泳动速率愈快;颗粒物理形状愈大,与支持物介质摩擦力越 大,泳动速度越小。即泳动率与颗粒的分子大小,介质粘度成反比;与颗粒所带电荷成正比。在检 测未知 DNA 分子量时, DNA 分子的空间构型不同, 即使相同的分子量其迁移率也不同。 如质粒 DNA 存在闭环(Ⅰ型,CC),单链开环(Ⅱ型,OC)和线性(Ⅲ型,L)。三者之间的迁移速率,一般为Ⅰ型> Ⅲ型>Ⅱ型,但是有时也会出现相反的情况,因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及溴乙锭染料 含量有关。当胶浓度较高或电场强度较大时,Ⅰ型 DNA 与Ⅲ型 DNA 互换位臵,而Ⅱ型 DNA 总是 迁移最慢。 (2)支持物介质:DNA 的凝胶电泳常使用两种支持材料:琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。通过这两种 介质的浓度变化调整所形成凝胶的分子筛网孔大小,分离不同分子量的核酸片段。琼脂糖凝胶的孔 径大, 可以分离长度为 100bp 至近 60kb 的 DNA 分子; 聚丙烯酰胺凝胶的孔径小, 可分离小片段(5~ 500bp)DNA,效果最好。因此,选用不同的凝胶种类和浓度可以分辨大小不同的 DNA 片段。 (3)电场强度: 电泳场两极间单位支持物长度的电压降即为电场强度或电压梯度。 电场强度愈大, 带电颗粒的泳动速率愈快,但凝胶的有效分离范围随电压的增大而减小。在低电压时,线性 DNA 分 子的泳动率与电压成正比。 一般凝胶电泳的电场强度不超过 5V/cm; 对于大分子量真核基因组 DNA 片段的电泳常采用 0.5~1.0V/cm 电泳过夜, 以取得较好的分辨率和整齐的带型。 电压 1000~2000V, 电场强度 20~600V/cm 的电泳为高压电泳,必须用聚丙烯酰胺做介质。 (4)缓冲液离子强度:缓冲液是电泳场中的导体,它的种类、pH 值、离子浓度直接影响电泳的 效率。Tris.C1 缓冲体系中,由于 Cl 的泳动速度比样品分子快得多,易引起带型不均一现象,所以 常利用 TAE、TBE 和 TPE 三种缓冲体系。缓冲液的 pH 值直接影响 DNA 解离程度和电荷密度,缓 冲液 pH 值与 DNA 样品的等电点相距越远,样品所携带电荷量越多,泳动速度越快。DNA 电泳缓 冲液,常采用偏碱性或中性条件,使核酸分子带负电荷,向正极泳动。缓冲液的离子强度与样品泳 动速度成反比,电泳的最适离子强度一般在 0.02~0.2 之间。
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2.指示剂 电泳过程中,常使用一种有颜色的标记物以指示样品的迁移过程。核酸电泳常用的指示剂有是 溴酚蓝,溴酚蓝呈蓝紫色,分子量为 670Da,在不同浓度凝胶中,迁移速度基本相同,它的分子筛 效应小,近似于自由电泳,故被普遍用作指示剂。在 0.6%,1%,2%的琼脂糖凝胶中,溴酚蓝的迁 移率分别与 1kb,0.6kb 和 0.15kb 的双链线性 DNA 片段大致相同。指示剂一般加在电泳上样缓冲液 中,为了使样品能沉人胶孔,还要加入适量的蔗糖、聚蔗糖 400 或甘油以增加比重。 3.染色剂 核酸需经过染色才能显示出带型,最常用的是溴乙锭染色法。溴乙锭(ethidium bromide,EB)是 一种荧光染料,这种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对碱基之间,在紫外线激发下,发出红色荧光。 EB-DNA 复合物中的 EB 发出的荧光,比游离的凝胶中的 EB 本身发出的荧光强大 10 倍,因此不需 要洗净背景就能清楚地观察到核酸的电泳带型。通常,可以在凝胶中加入终浓度为 0.5μg/m1 的 EB,这样在电泳过程中可以随时观察核酸的迁移情况,这种方法适用于一般性的核酸监测。也可以 在电泳结束后用 0.5μg/m1 的 EB 溶液染色 10-15min 后进行紫外观察, 由于 EB 在可见光下易分解, 故应存棕色瓶中于 4℃条件下保存。[注意]:EB 有潜在的致癌危险,操作时必须戴乳胶手套或一次 性手套。

实验内容:
试剂
(1)质粒 pNTE-EGFP。 (2)琼脂糖。 (3)10mg/ml 溴乙锭溶液。 (4)DNA 分子量参照物(marker) 。 (5)50×TAE 电泳缓冲液。 (6)10×溴酚蓝上样缓冲液。

2.器材 (1)恒温水浴 (2)电泳槽 (3)电泳仪 (4) 微波炉 (5)紫外线检测仪 (6)移液器;100-1000μl, 10-100μl,0.5-10μl

操作步骤
电泳 (1) 称取 1.0 g 琼脂糖,加入 100ml 1×TAE 电泳缓冲液中。

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(2) 加热或沸水浴后使琼脂糖溶解。 (3) 凝胶冷至 60℃左右,加入溴乙锭至终浓度为 0.5μg/m1。 (4) 将琼脂糖溶液倒人模具,凝胶厚度一般为 0.3~0.5cm,检查有无气泡。室温下 15~30min 后,琼 脂糖溶液完全凝固。 (5) 连接电泳槽与电泳仪之间的电源线,正极为红色,负极为黑色。 (6) 取掉模具两端的胶布,放入电泳槽,加样孔在负极端。 (7) 加入 1×TAE 电泳缓冲液至电泳槽中,液面高于胶面 1mm,小心取出梳子。 (8) 取 5μl 实验一制备的质粒 DNA,在 DNA 样品中加入 1/10 的上样缓冲液并混匀。 (9) 用移液器将 DNA 样品加入梳孔中。 (10)接通电源,DNA 样品往正极移动。电压选择为 3~5V/cm。注意:长度以两个电极之间的距离 计算。 (11)根据指示剂迁移的位臵,判断是否终止电泳;切断电源后,含 EB 的凝胶可以直接于紫外线灯下 观察结果或拍照记录。 浓度和纯度分析: 1 取 10μl DNA 用 TE 缓冲液稀释至 1ml, 混匀。 以无 DNA 的 TE 为空白, 测定样品在 260nm 和 280nm 波长下的光密度吸收值,每个样品重复 3 次,取 3 次结果的平均值作为最终结果。 2 换算出 OD260/OD280 的比值,较纯的 DNA,该值在 1.6-1.8 之间。 3 根据双链 DNA 1 OD260nm=50?g,计算出样品 DNA 的浓度,计算公式为所测的

OD260nm ×50/10(?g/?l)

附录一、核酸换算数据

dsDNA ssDNA RNA

10kb=6.60?106 Dalton 10kb=3.30?10 Dalton 10kb=3.45?10 Dalton
6 6

1 OD 260nm=50?g 1 OD 260nm=40?g 1 OD 260nm=40?g

附录二、琼脂糖凝胶浓度与线性 DNA 的最适分辨范围
琼脂糖凝胶浓度 0.5% 0.7% 1.0% 1.2% 1.5% 2.0% 线性 DNA 的最适分辨范围(bp) 1,000-30,000 800-12,000 500-1,000 400-7,000 200-3,000 50-2,000

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实验三 PCR 产物的 TA 克隆 实验目的:掌握通过 TA 连接克隆 PCR 产物的原理和方法。 实验原理: PCR 的方法扩增目的基因片断的过程中, 通过 由于往往不清楚目的基因的 DNA
序列,获得的目的片断通常需要通过 TA 克隆的方法,重组到 T-载体中,通过序列测定清楚 DNA 序列。由于在 PCR 过程中,使用的 DNA 聚合酶不同,往往分为 2 种情况:(1)使用不同的 Taq 酶,在 PCR 扩增循环结束后,加上 72℃ 10 分钟一个过程,Taq 酶可以在扩增产物的 3 末端加上 A, 因此 PCR 产物回收纯化后可以和 T 载体直接连接。(2)使用高保真的 DNA 聚合酶,如 pfu 酶,由 于其不能在扩增产物的 3 末端加上 A,得到的 DNA 序列为钝端,因此,需要在回收纯化后进行加 A 的过程, 通常是以 PCR 回收产物为模板, 加上一定量的普通 Taq 酶和反应液, 加入 dATP (或 dNTP) , 72℃ 10 分钟,然后将加 A 产物直接用于 TA 连接。

下图是大连宝生物公司的 T 载体及其说明书。

pMD 18-T Vector 是一种高效克隆 PCR 产物 (TA Cloning) 的专用载体。 它是 TaKaRa 独自研究开发, 由 pUC18 载体改建而成的。在 pUC18 载体的多克隆位点处的 Xba I 和 Sal I 识别位点之间插入了 EcoR V 识别位点, EcoR V 进行酶切反应后, 用 再在两侧的 3'端添加―T‖而成。 因大部分耐热性 DNA 聚合酶反应时都有在 PCR 产物的 3'末端添加一个―A‖的特性,所以使用本制品可大大提高 PCR 产物的 连接、克隆效率。本制品是以最为常用的 pUC18 载体为基础研制而成,所以它具有同 pUC18 载体 完全相同的功能。此外,本制品中的高效连接液 Ligation Solution I 可以在极短的时间内 (30 分钟-1

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小时) 完成连接反应,大大地方便了实验操作。另外,本制品中还含有 Control Insert (500 bp),可用 于 Control 反应。 用途:克隆 PCR 产物。对克隆后的 PCR 产物用 M13 Primers 进行 DNA 测序。

α互补和蓝白筛选的原理:许多载体(包括 pMD18-T)都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启
动子和编码其 N 端氨基酸(α肽链)的片断基因。宿主具有编码β半乳糖苷酶的 C 端基因。当二者 产物组合在一起,就具有活性酶的产生,此现象称为α互补。由α互补形成的具有功能活性的β半 乳糖苷酶,可以用 X-gal 显色测定出来,它能将无色的化合物 Xgal 切割成半乳糖和蓝色底物。当外源 DNA 片断插入到多克隆位点后,就会破坏α肽链的阅读框,从而不能合成与受体菌内的β半乳糖苷 酶相互补的活性α肽链,而导致不能形成功能活性的β半乳糖苷酶,因此含有重组质粒载体的克隆 往往是白色的,而没有插入外源片断的则是蓝色的。

实验内容: 试剂
pMD 18-T Vector 试剂盒,或自己 PCR 扩增回收纯化的片段,T4DNA 链接酶。IPTG,X-gal, LB 培养基等。 200mg/ml 的 IPTG 过滤除菌 20mg/ml 的 X—gal 溶于二甲基甲酰胺,避光保存。

操作步骤
1. 在微型离心管中制备下述连接反应液,全量为 10 ?l。

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取 0.5 ?l 进行实验也可得到满意的结果。实际操作时,可按实验需要使用适量的 T 载体。

2. 16℃反应 30 分钟 (过夜反应也不影响连接效率)。 3. 全量 (10?l) 转化至 JM109 感受态细胞 (100 ?l)中。 4. 在含有 40?l 20mg/ml 的 X-Gal、4?l 200mg/ml 的 IPTG、50-100?g/ml Amp 的 L-琼脂平板培养基 上培养,形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。 5. 挑选白色菌落,使用 PCR 法确认 T 载体中插入片段的长度大小。

注意事项:
1. Ligation Solution I 请于冰中融解。 2. 在进行克隆时,Vector DNA 和 Insert DNA 的摩尔比一般为:1: 2 ~ 10。在本制品中, pMD18-T

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Vector 1 ?l (50 ng) 的摩尔数约为 0.03 pmol, Control Insert DNA 1?l (50 ng) 的摩尔数约为 0.15 pmol。 3. 克隆时使用的 Insert DNA 片段 (PCR 产物) 尽量进行切胶回收纯化,PCR 产物中的短片段 DNA(甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段)、残存引物等杂质都会影响 TA 克隆的效率。 4. 按照本实验操作进行连接后,直接进行转化时的连接液不要超过 20 ?l。当进行转化的 DNA 用量 较大或准备进行电转化时,需对连接液进行乙醇沉淀,纯化 DNA 后再进行转化。 5. 连接反应请在 16℃下进行,温度升高 (>26℃) 较难形成环状 DNA。 6. 连接效率偏低时,可适当延长连接时间至数小时。 7. 感受态细胞可使用适合于 pUC 系列载体的感受态细胞,如:JM109,DH5a 等。

相关问题
怎样提高 pMD18-T Vector 的克隆效率?

1. 纯化 PCR 产物。切胶回收的 PCR 片段最好 2. 除去残存的引物等杂质。 3. DNA 片段的立体结构、DNA 片段的长短都会影响克隆效率。一般情况下,大片段 DNA 的克隆效 率(连接效率与转化效率)小于短片段 DNA,在使用大片段 DNA 的连接液进行转化时,建议采用 电转化方法。

PCR 产物难以插入载体,为什么? 1. 确认 PCR 反应使用的 DNA 聚合酶在 PCR 产物的 3'端是否附加了"A"。有些 DNA 聚合酶扩增的 PCR 产物是平端, 如使用本公司的 Pyrobest DNA 聚合酶 (TaKaRa Code: DR005) 等扩增得到的 PCR 产物不能直接用于 TA 克隆; PCR 产物保存时间不要过长, 长时间保存的 PCR 产物会脱去末端的"A" 碱基。 2. PCR 产物中短片段杂质 DNA 太多,这时应切胶回收纯化 DNA 片段,回收时 PCR 产物不要在紫 外线下暴露时间过长。 3. 确认感受态细胞的转化效率,使用的感受态细胞的转化效率最好大于 108 cfu/?g pUC118 DNA。 4. 确认 Ligation Solution I 的连接效率是否降低,多次反复冻融会降低的 Ligation Solution I 连接效 率。 5. 确认抗生素的浓度是否过大。 6. 最好使用新配制的平板培养基。

转化后的菌落全为蓝色 (或淡蓝色),为什么? 插入的 PCR 片段较短(小于 500 bp),且插入片段没有影响 lacZ 基因的读框时,平板培养基上出现 的菌落有可能呈现蓝色。

插入的 PCR 产物进行测序时,可使用何种引物? 本制品的载体来源于 pUC18 载体。因此,用于 pUC18 载体测序的引物都可以使用。
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实验四

感受态大肠杆菌细胞的制备

实验五 重组 DNA 转化大肠杆菌 实验目的 实验原理
掌握 CaCl2 制备感受态大肠杆菌的方法和化学转化法。

通过冰冷的 CaCl2 溶液处理大肠杆菌,细菌处于 0℃、CaCl2 低渗液中,菌细胞膨胀成

球形,使之处于短暂的“感受态” ,在这期间,细菌能够摄取各种不同的外源 DNA 片段或基因,使 受体细胞获得供体基因的某些性状,质粒 DNA 的转化是重组 DNA 技术中重要的一环。

常用的转化方法
1.化学法转化 包括了 CaCl2、氯化钙/氯化铷、MgCl2 等方法,所有化学法转化均需制备感 受态细胞。 通过化学方法,可人工诱导细菌细胞进入感受态,最经典的是 CaCl2 法(1972 年) ,其原理是细 菌处于 0℃、 CaCl2 低渗液中, 菌细胞膨胀成球形, 转化混合物中的 DNA 与钙离子结合形成抗 DNase 的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经 42℃短时间热冲击处理,促进细胞吸收 DNA 复合物;通 过在丰富培养基中恢复 1h 左右,球状细胞复原,转化子中的抗性基因得以表达;随后将菌液涂布于 含抗生素的选择性培养基平板上,转化子可分裂、增殖,形成菌落。 转化效率是衡量菌体处于感受态的细胞多少的指标, 一般定义为 1μg 环状质粒 DNA 在感受态 细胞过量的情况下产生转化子的个数。Ca2+处理的感受态细胞,转化效率可达 105~106 个转化子/ μg 环化 DNA。 影响转化率的关键因素:①生长时期:实验发现在对数中期的大肠杆菌易生成感受态。转化时 菌浓度应控制在不超过 107/ml。②CaCl2 法 0℃放臵时间的影响:细菌经 0℃ CaCl2 处理后转化率 随时间的推移而增加,24h 达到最高,之后转化率逐渐下降。③化合物及无机离子的影响:在 Ca2+ 的基础上,联合其他二价金属离子(如 Mn2+,CO2+)、DMSO 或还原剂等物质处理细菌,可使转化率 提高 100~1000 倍。④质粒大小、构型的影响:通过构建相同复制起点的不同大小质粒进行转化时 发现,从 2kb 到 3.2kb 的转化效率上升,此后到 66kb 转化效率线性下降。同时,开环状质粒只有 超螺旋质粒转化率的 75%,线型质粒的转化率更要低 100~1000 倍,线型转化率低是因菌体中核酸 外切酶将进入的线型 DNA 降解的原因。⑤菌株基因型 recA+与 recA—的影响:recA 基因是 rec 系列 中最主要的基因,编码同源重组蛋白。考虑到质粒 DNA 在 recA+菌中存在与细菌染色体 DNA 整合 的可能,因而,通常在转化实验中都选用 recA 菌株作为宿主菌。


实验内容
试剂与材料

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1.菌株 DH5?等。 2.重组质粒 pNTE-GFP。 3.100mmol/L CaCl2,用纯水配制。 4.氨苄青霉素(100mg/m1),用无菌水配制并过滤(0.22μm)除菌,滤液于-20℃冰箱中保存。 5.LB 平板 LB 培养液中加入 1.5%琼脂粉,高压消毒(15 磅 20min),稍冷却后铺平板。 6.含抗生素 LB 平板 配方同上,高压消毒后,冷却至 65℃左右,加入氨苄青霉素,终浓度为 50~100μg/m1 培养液,加入抗生素后立即倒平板。 7.培养皿及 1.5ml 离心管等。

操作步骤
1. 将 DH5?细菌接种在 LB 平板上,37℃培养过夜。 2.从 LB 平板上挑取 DH5?单个菌落接种在 5ml LB 培养基中,37℃振荡培养过夜。 3. 次日取 0.5-1.0ml 上述菌液, 接种于 50 ml 新鲜 LB 培养液中, 37℃振荡培养 OD600=0.4-0.5; 4℃10min,然后 4℃ 4000r/min 离心 8min,弃去上清液。 4. 沉淀的菌体悬浮于 20m1 0.1mol/L 冷 CaCl2 内,冰浴中放臵 30min,4℃4000r/min 离心 8 min。 5.沉淀的菌体再悬浮于 2m1 0.1mol/L 冷 CaCl2 溶液,并臵于冰浴中。 (感受态细菌可以在 12.5%的无菌甘油-70℃保存) 6.取 3 支 1.5ml 离心管,按下表加试剂和操作: 试 连接产物 质粒(100ng/μ1) H2O 感受态细胞 7.冰浴中放臵 30min。 8.42℃热冲击 90s 后,立即放入冰浴,放臵 2-5 分钟。 9.每管加入新鲜 LB 培养液 0.85m1。 10.37℃剧烈振摇培养 60min。 (转速不低于 225RPM) 11.5000r/min 离心 1min, 弃去上清液保留培养基 100~200μl,充分悬浮细菌,分别涂布于 含氨苄青霉素的 LB 平板,加入的菌液用玻棒均匀推开。以上操作均需在无菌条件下进行。平板在 37℃温箱内培养过夜。 次日观察各平板上菌落生长情况, 并算出转化率即每微克 DNA 能转化多少个 细菌。 200μl 剂 管1 10μl 1μl 9μl 200μl 10μl 200μl 管2 管3

注意事项
1.致敏缓冲液中试剂的纯度与浓度对转化率影响很大,试剂必须为分析纯,同时,致敏缓冲液
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最好避光贮存于 40C。 2.制备感受态细胞的全部操作均须于冰浴低温操作,同时注意无菌操作,防止感受态细胞受杂 菌污染。 3.42℃热处理时间很关键,转移速度要快,且温度要准确,同时注意热处理过程中离心管不要 摇动。 4.菌液涂皿操作时,应避免反复来回涂布,因为感受态细菌的细胞壁有了变化,过多的机械挤 压涂布会使细胞破裂,影响转化率。 5.实验用的玻璃器皿、微量吸管及 Eppendorf 管等,应彻底洗净并进行高压消毒,表面去污剂 及其他化学试剂的污染往往大幅度地降低转化率。

【思考题】
1.影响 CaCl2 法转化率的关键因素有哪些?如何提高转化率? 2.涂布菌液时应注意什么?

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实验六 实验目的:

PCR 扩增基因特异片段

学习 PCR 体外扩增的原理及其引物设计原则; 了解扩增过程中各因素对扩增结果的影响; 掌握 PCR 的基本操作。

实验原理
PCR(polymerase chain reaction)是在体外进行的由引物介导的酶促 DNA 扩增反应。在分子生物 学研究中,广泛地应用于研究基因突变,获取加上酶切位点的目的基因和 DNA 序列测定等方面,是 分子生物学中一项极为常用的技术。 PCR 的原理是在模板 DNA、引物和 4 种脱氧核糖核苷酸(dNTP)存在的条件下,依赖于 DNA 聚 合酶的体外酶促合成反应。两个引物分别位于靶序列的两端,同两条模板的 3'端互补,由此限定 扩增片段。PCR 反应由一系列的变性——退火——延伸反复循环构成,即在高温下模板双链 DNA 变性解链, 然后在较低的温度下同过量的引物退火, 再在适中的温度下由 DNA 聚合酶催化进行延伸。 由于每一循环的产物都可作为下一循环反应的模板,因此扩增产物的量以指数级方式增加。理论上, 经过 n 次循环可使特定片段扩增到 2n-1,考虑到扩增效率不可能达到 100%,实际上要少些,通常经 25~30 次循环可扩增 106 倍,这个量足够分子生物学研究的一般要求。

(一)PCR 引物设计
1.Tm 值 Tm 值是 PCR 引物设计中的一个重要参数,是指引物与模板之间精确互补并且在模

板过量的情况下有 50%的引物与模板配对,而另外 50%的引物处于解离状态时的温度,Tm 值一般 高于 55℃。合适的引物选择应需考虑到以下因素,如 Taq 酶的最适温度(TE)和 Tm 值等。最常用的 Taq 酶的最适温度(TE)范围为 70~74℃,根据 TE 可以先确定一个合适的退火温度范围(Ta)。这个温 度范围应不高于酶的最适反应温度,也不能比 TE-25℃更低。这是因为如果退火温度低于酶的最适 反应温度时,酶的合成反应会非常缓慢,但片面考虑提高温度又会造成引物脱落而不能进行 PCR 扩 增。所以 Ta 的选择应满足 TE-25℃<Ta<TE。 2.引物的长度 引物长度一般在 15~30 个核苷酸之间比较合适。引物过短时造成 Tm 值过低, 不能与模板很好地配对或是配对专一性很低。引物过长时又会造成 Tm 值过高,超过酶的最适反应 温度,还使合成引物的费用大大增加。当然若要在引物的 5'末端加上特定的酶切位点等碱基则可 稍长。 3.引物的 GC%含量 引物的 GC 比最好设计在 40%~60%的范围内。GC 比过高与过低都会

直接造成 Tm 值的过高与过低。 如上所述, 值的估计可简单地根据经验式 Tm=4× Tm GC+2× AT+3.3℃ 获得。
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4. 引物 3′端起始碱基

Taq 酶在 3′末端错配时延伸效率是不一样的, 延伸效率为 T>G=C>A。

即当引物 3′末端为 A 时,即使有错配碱基也最不易延伸,所以引物设计时可将 3′末端设计为 A, 以提高复制精确性。另一种理论是 3′末端应设计为 G 或 C,因为 G 和 C 的氢键多于 A 与 T,能更 好地与模板结合开始 DNA 合成,当然对错配延伸效率方面就不能苛求了。总而言之,引物的 3′末 端不要考虑使用 T。 5.引物无发卡结构 引物自身应无发卡结构。 6.二引物自身之间不能配对 二引物自身不能配对是指同一对引物之间不能有配对的多个碱

基,特别是在引物的 3′末端。二引物间不能配对的道理与二引物本身不能配对相同,若发生这种 情况会形成引物二聚体,造成扩增失败。一般引物自身配对形成茎环结构,茎的碱基对数不大于 3, 两条引物间配对碱基数小于 5 个。 7.二引物的 Tm 值 引物设计时应注意使二引物的 Tm 值相近,否则二个引物必然不能同时达 到最佳退火温度,将会影响 PCR 扩增效果。能同时达到最佳退火温度,将会影响 PCR 扩增效果。 由于影响引物设计的因素比较多,所以常利用计算机来辅助设计,通常可用 primer 5.0 软件或其它 PCR 引物设计程序来帮助设计。

(二)PCR 反应条件
1. PCR 缓冲液 常用的 1×PCR 缓冲液为 10mmol/L Tris-HCl pH8.3(常温), 50mmol/L KCl, 1.5mmol/L MgCl2。由试剂公司与 Taq 酶一起提供。 (1)Mg2+离子浓度:Mg2+离子浓度对 PCR 反应影响很大,因为[Mg2+]与引物-模板及产物的解链 温度、产物的特异性、引物二聚体的生成、产物的忠实性、酶活力、产物的产量等诸多因素有关。 Mg2+一般使用浓度为 0.5~2.5mmol/L,必要时可以 0.5mmol/L 梯度间隔做 Mg2+最适浓度试验。 (2)dNTP:常用 dNTP 浓度为 20μmol/L(可用范围为 20~200μmol/L)。dNTP 的用量与 PCR 产量及产物忠实性有关,dNTP 量过少时合成的产物减少。可以被 Taq 酶接受的经过修饰的 dNTP 有 以下几类:dig-11dUTP、5—bromo-dUTP、biotin-11—dUTP、biotin-16—dUTP、7—deaza-dGTP 和次 黄嘌呤。但不是所有的聚合酶都能接受经过修饰的 dNTP。 (3)K+离子浓度:PCR 反应中 K+离子的作用是促进 Taq 酶活力与促进引物退火,一般使用浓度 是 50mmol/L,但当 K+离子浓度高于 50mmol/L 时会抑制 Taq 酶活力。 (4)pH 值:PCR 反应中用的是 Tris-HCL 缓冲系统。Tris-HCL 缓冲系统的特点是具有很高的温度 系数(0.021pH/℃), 20℃时 pH 为 8.3 的缓冲液在 72℃延伸反应时, 实际 pH 值降低至 7. 而 Tricine 2。 的温度系数较高,在扩增长片段时用 Tricine 系统。 (5)保护剂:由于 PCR 反应体系中蛋白的含量极低,所以加人的酶非常容易变性,通常需加入一 定量的保护剂。如 5mmol/L 的二硫苏糖醇(DTT),100μg/ml 的小牛血清白蛋白(BSA)或 0.01%的 明胶。加入保护剂对 PCR 循环数较多的扩增反应效果尤其明显。 2.模板 PCR 模板可以是 DNA 或 RNA,RNA 需反转录后再扩增。模板可以是基因组 DNA 或纯化的质粒 DNA,当然两者的 DNA 量在 PCR 起始模板中相差很大。每个 PCR 反应中加入的模

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板数量可在 102~105 分子之间,必要时可低至 50 个分子,模板的量少时应酌情增加循环次数。小于 100ng 的哺乳动物细胞基因组 DNA(相当于约 104 个细胞),经 30 个循环,10%的反应物应能够在溴 化乙锭染色的凝胶上看到一条主要产物带。使用较大量的模板时,循环数可减少;如果模板量很少, 可能需要增加至 45 个循环反应。 3.引物浓度 常用引物浓度为 0.1~0.5μmol/L。随着引物浓度的降低,PCR 反应的特异性提 高但产物得率降低;随着引物浓度的升高,情况正好相反。 4.PCR 反应中的酶 Taq 酶最早是从水生嗜热菌(thermus aquaticus)中分离得到的,该酶的最适 温度是 72℃,在 94℃时相当稳定,半衰期长达 38min。由于这种酶使用最早最广泛,文献中所列各 项最适反应条件都是针对此酶优化的,使用其它的聚合酶时按试剂盒使用说明书操作。

实验内容
仪器和试剂
1.仪器 PCR 仪,微型水平电泳槽,电泳仪等。 2.试剂 (1)50×TAE 电泳缓冲液 (2)10×PCR 缓冲液: (3)4 种 dNTP 混和液 (4)Pfu DNA 聚合酶 (5)引物(20μM) (6)10×溴酚蓝上样缓冲液 10mmol/L (5U/μl)

方法和步骤
1. 在 PCR 仪上设臵好程序。 2. 在两个灭菌的 0.5ml 离心管中,按下列顺序加样,建立 20μl 反应体系。 ddH20 10×PCR Buffer dNTP(10mM each) Primer l(20μM) Primer 2(20μM) 模板 DNA (50ng)D16 Pfu DNA 聚合酶(2.5U) 总体积 15μl 2μl 0.5μl 0.5μl 0.5μl 1μl 0.5μl 20μl

对照水(空白对照)
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3.混匀,短暂离心. 4.放在 PCR 仪上进行 PCR 反应。94℃变性 3min,94℃45 秒,64℃ 1 分钟,72℃3 分钟,20 个循环。 (用旧式的 PCR 仪进行基因扩增时还要求覆盖约 50μl (一滴)液体石蜡油,改进后 的 PCR 仪已经不用液体石蜡油覆盖。 ) 5 . 取 5μl PCR 反应液及 1μl 上样缓冲液混合,进行琼脂糖电泳(5V/cm),选择适当大小的 DNA 分子量标准(DL2000) ,检查扩增产物。紫外观察,必要时拍照。

注意事项
1.PCR 是建立在一定量的模板和与之专一性互补配对的一对引物之上的, 因此, 在进行 PCR 前, 模板的纯化和引物设计尤为重要。 2.Mg2+对 Taq DNA 聚合酶的活性影响很大,有时按照试剂商提供的说明扩增不出目的基因时, 不妨适当增加 Mg2+的浓。

【思考题】
1. PCR 的原理是什么? 2. PCR 中引物和 TaqDNA 聚合酶各有什么作用? 3. PCR 中怎样预防出现假阳性结果? 4. 什么是 Tm 值?有何用途?如何计算? 5. 引物设计应遵循什么原则? 6. 你会使用哪种引物设计软件?

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实验七 实验目的

DNA 片段的回收及纯化

了解琼脂糖凝胶电泳中回收 DNA 片段的常用方法,掌握根据实际情况选用方法的原则,并用 试剂盒从琼脂糖凝胶中回收 PCR 产物 DNA 片段。

实验原理
DNA 片段的分离与回收是基因工程操作中一项重要的技术,例如可收集特定酶切片段用于克 隆或是制备探针,回收 PCR 产物用于再次鉴定等。回收实验中两个最重要的技术指标是产物的纯度 与回收率:纯度未达标时会严重影响以后的酶切、连接、标记等酶参与的反应;回收率不理想时往 往会大大增加前期工作量。 1.低熔点胶法 低熔点胶是向普通琼脂糖的多糖链上引入羟乙基形成的,这一变化会使凝胶的 熔化点与凝固点均降低。低熔点胶在 30℃时凝结、65℃时熔化,这一温度尚不足以使 DNA 分子变 性。 操作时可先灌一块普通的胶, 然后用低熔点胶取代其中的回收部分。 割下的胶加入 TE 后于 65℃ 保温促使凝胶熔化,再加入等体积的酚抽提去除凝胶。低熔点胶的另一个特点是电泳回收后可以立 即进行酶切连接、标记等酶反应,因为这类胶中不含有普通琼脂糖中抑制酶活性的硫酸盐等杂质, 并且收集的胶条能在酶反应的合适温度(37℃)始终保持液体状态。 2.玻璃粉(乳)法 将胶条割下加入 NaI 溶液浸泡,剧烈振荡数分钟促使溶胶。向胶液中加入经

酸净化处理的极细玻璃粉(乳),室温反复倒转离心管使 DNA 吸附于其上。离心收集玻璃粉后加入 TE 并于 37℃保温,洗脱吸附于玻璃粉上 DNA,再次离心收集含 DNA 的上清液即可。玻璃粉法适 用于回收 0.4~1kb 的小分子片段,均有 80%的回收率。 3.QIAgen 胶回收试剂盒 由于凝胶溶于含 NaI 的溶胶液,DNA 能专一地与离心柱中纤维素结

合。结合后的 DNA 经洗涤除去杂质,最后在低盐缓冲液中经离心从纤维素上洗脱下来。

4 其他试剂盒, 本实验采用的是北京塞百盛生物技术公司的 PCR 产物回收试剂盒。 基本原理
是,在高盐状态下,纯化树脂专一性地吸附 DNA;而在低盐或水溶液状态下,DNA 被洗脱下来。 此法简便快捷,可在几分钟内从 PCR 反应液,或十几分钟内从普通琼脂糖凝胶中回收高纯度的 PCR 产物, 用于 DNA 测序及其它酶促反应。 其回收率分别为 85%和 70%左右。 该系统不仅用于纯化 PCR 产物,还可以从反应液或普通琼脂糖凝胶中回收各种类型的 DNA 片段,适用范围从 150bp 到十几 kb。

实验内容
试剂与器材

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试剂 (1)琼脂糖 (2)TAE 电泳缓冲液 (3)10×DNA 电泳样品缓冲液 (4)无菌水 (5)PCR 产物 (6)溴化乙锭(EB) (7)试剂盒包装及组成 1、纯化树脂 (于 GS 结合液中) 2、离心纯化柱(空柱子) (8)80%异丙醇或 80%乙醇 (9)超纯水或 TE 缓冲液 仪器 (1)台式高速离心机 (2)水浴锅 (3)电泳器材 20ml 50 套

实验步骤
1. 将无石蜡油的 PCR 反应液或酶切反应液(50μl~100?l 反应体系)在 1%的普通琼脂糖凝胶上 13 电泳,切下所需的 DNA 条带装入 2ml 离心管中。 尽量切掉不含 DNA 的琼脂糖凝胶,这样可简化操作、提高回收量及 DNA 片段的质量。 2. 200mg~400mg 琼脂糖凝胶中加入 0.4ml 纯化树脂(使用前充分混匀) ,70℃保温 5~10 分钟, 每两分钟颠倒混匀 1 次,使琼脂糖凝胶完全融化。 对于高浓度的琼脂糖凝胶(>2%) ,每 200mg 的琼脂糖凝胶中加入 0.5ml 纯化树脂,加热融胶的 时间延长到 15 分钟。 3. 将混和液转移入离心纯化柱,13,000rpm 离心 30 秒,倒掉收集管中的废液。 4. 加入 500?l 80%异丙醇(或乙醇) ,13,000rpm 离心 30 秒,倒掉收集管中的废液。 重复第 4 步一次,此步骤 13,000rpm 离心 2 分钟,务必将异丙醇 (或乙醇)除尽。如果离心 纯化柱上还残留有异丙醇(或乙醇) ,13,000rpm 再离心 1 分钟。 5. 将离心纯化柱套入干净的 1.5ml 或 2ml 离心管中,开盖放臵 2~3 分钟,务必使乙醇充分挥发 干净,加入 40?l TE 缓冲液(若用于测序,则加 40?l 超纯水)于纯化树脂上,不能粘在管壁上。放 臵 2 分钟后,13,000rpm 离心 30 秒。 TE 缓冲液或超纯水的用量视用户对浓度的要求而定。离心纯化柱放入离心管中,若盖不上盖 子,亦没有关系,可开盖离心。 6. 离心管中的液体即是纯化的 DNA 片段,取 4?l 电泳(0.8%琼脂糖,120V,10 分钟)检测并 目测定量。-20℃保存备用。

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注意事项
1 低熔点胶回收 DNA 时,切除不含样品的凝胶,保证样品凝胶尽可能地要小。 2 室温低于 25℃时,纯化树脂 (于 GS 结合液中)可能出现结晶或盐析,此时请务必预热,使其完 全溶解后使用。 。 3 纯化树脂(于 GS 结合液中)为灰褐色粉状物质,静臵时沉淀于瓶底,使用时要充分混匀。

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实验八 实验目的

PCR 法快速鉴定重组载体

掌握 PCR 法快速鉴定重组载体的基本操作。

实验原理
PCR(polymerase chain reaction)是在体外进行的由引物介导的酶促 DNA 扩增反应。在分子生物 学研究中,广泛地应用于研究基因突变,获取加上酶切位点的目的基因和 DNA 序列测定等方面,也 可以用来鉴定重组载体,是分子生物学中一项极为常用的技术。 PCR 的原理是在模板 DNA、引物和 4 种脱氧核糖核苷酸(dNTP)存在的条件下,依赖于 DNA 聚 合酶的体外酶促合成反应。两个引物分别位于靶序列的两端,同两条模板的 3'端互补,由此限定 扩增片段。PCR 反应由一系列的变性——退火——延伸反复循环构成,即在高温下模板双链 DNA 变性解链, 然后在较低的温度下同过量的引物退火, 再在适中的温度下由 DNA 聚合酶催化进行延伸。 由于每一循环的产物都可作为下一循环反应的模板,因此扩增产物的量以指数级方式增加。理论上, 经过 n 次循环可使特定片段扩增到 2n-1,考虑到扩增效率不可能达到 100%,实际上要少些,通常经 25~30 次循环可扩增 106 倍,这个量足够分子生物学研究的一般要求。PCR 法快速鉴定重组载体的 基本原理是直接取沸水浴裂解的重组质粒 DNA 为摸板, 通过特异引物的特异扩增来鉴定外源片段是 否重组。

实验内容
仪器和试剂
1.仪器 PCR 仪,微型水平电泳槽,电泳仪,水浴锅,离心机等。 2.试剂 (1)50×TAE 电泳缓冲液 (2)10×PCR 缓冲液: (3)4 种 dNTP 混和液 (4)Pfu DNA 聚合酶 (5)引物(20μM) (6)10×溴酚蓝上样缓冲液 10mmol/L (5U/μl)

方法和步骤
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1 取培养过夜的转化菌液 20μl,沸水浴 3-5 分钟。 2 12000rpm 离心 2 分钟。取上清液作为 PCR 的摸板 3 在 PCR 仪上设臵好程序。 4 在 1 个灭菌的 0.5ml 离心管中,按下列顺序加样,建立 20μl 反应体系。 ddH20 12μl

10×PCR Buffer 无 Mg 离子) 2μl ( 25mM Mg 离子 dNTP(10mM each) Primer l(20μM) Primer 2(20μM) 模板 DNA TaqDNA 聚合酶(2.5U) 总体积 5 混匀,短暂离心. 6 放在 PCR 仪上进行 PCR 反应。94℃变性 3min,94℃45 秒,64℃ 1 分钟,72℃3 分钟,20 个循环。 (用旧式的 PCR 仪进行基因扩增时还要求覆盖约 50μl (一滴)液体石蜡油,改进后的 PCR 仪已经不 用液体石蜡油覆盖。 ) 7 取 10μl PCR 反应液及 1μl 上样缓冲液混合,进行 1% 琼脂糖电泳(5V/cm),选择适当大小的 DNA 分子量标准(DL2000) ,检查扩增产物。紫外观察,必要时拍照。如果得到与插入片段大小一 致的片段,说明已经成功重组。 1.5 0.5μl 0.5μl 0.5μl 2μl 1μl 20μl

注意事项
1.PCR 是建立在一定量的模板和与之专一性互补配对的一对引物之上的, 因此, 在进行 PCR 前, 菌液的充分裂解变性和引物设计尤为重要。 2.Mg2+对 Taq DNA 聚合酶的活性影响很大,有时按照试剂商提供的说明扩增不出目的基因时, 不妨适当增加 Mg2+的浓。

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实验九 实验目的

限制性内切酶酶切法鉴定重组质粒

掌握单、双酶切的技术,理解酶切法进行重组质粒进行鉴定的原理。

实验原理
(一)酶切
各种限制性内切酶能专一地识别碱基顺序,例如,EcoRⅠ酶的识别顺序为:GAATTC;Scal I 酶的识别顺序为:AGTACT,用 EcoR I 和 Scal I 同时酶解含有这两个单一酶切位点的环状双链 DNA 分子,就产生两条带有相应酶切位点的线性 DNA 分子。 当 EcoR I 和 Scal I 同时酶切一个质粒 DNA 时,酶切反应必须完全。不同酶切反应都需要 Mg2+ 并要求一定的盐离子浓度,但不同的酶达到最佳酶切效率所需的盐浓度不同。因此生产厂商在销售 酶的同时往往附带专门的缓冲液。如果盐离子浓度使用不当,会使酶的识别位点发生改变,例如当 盐离子浓度低于 50mmol/L 时, EcoR I 内切酶的专一性就降低, 只能识别中间的 4 个核苷酸序列(称 该酶为 EcoR I*)。绝大多数酶的反应温度是在 370C,酶切反应时间需 30min、60min 以至 2h 以上。 一般来说,如酶的纯度不佳,酶切时间不能太长。终止酶切反应时,大多数可在 65℃水浴中,保温 10min,就可使大部分酶失活。EcoR I 酶臵 65℃水浴中,保温 10min,丧失 95%的酶活性。内切酶 一般都保存在 50%甘油的缓冲液中。当保存在 10%甘油中时,酶活力丧失更快。少数较耐热的酶, 在加热前先加 pH7.5 的 EDTA,至终浓度为 10mmol/L。EDTA 螯合了反应系统中所有的二价阳离 子,就更便于终止酶切反应。 酶切要完全,酶解的数量也要适当。设计酶解 DNA 的数量时,除了根据连接与转化的要求外, 还要按照 DNA 浓度的高低, 酶液单位的高低等具体情况而定。 同时还要考虑到 DNA 每经一步处理, 就得重新纯化, 这样 DNA 浓度的损失量几乎达到 50%。 并且每经一步操作后, 都要取一定量的 DNA 样品进行电泳鉴定或作为电泳对照样品。因此,在设计酶解数量时,不能用量太少,但是酶解数量 过多,势必要消耗大量限制性内切酶和 DNA,这也是不必要的。 至于酶的用量,一般的做法是控制在 1U 酶在 15—20μl 中酶解 1μgDNA,但具体地分析应该 对不同的 DNA,酶的用量有所不同,如 EcoR I 酶对 4.3kb 的 pBR322 有一个切点,而对 14.5kb 的 pXZ 6 有两个切点,如果不考虑其他构型的影响,则每微克 pBR322 的酶用量与每微克 pXZ6 的用量 之比应该为 1.69:1(酶单位)。 酶解的体积,一般酶切 0.2~1.0μg 的 DNA 时,控制反应体积为 15~20μl。根据酶解 DNA 的 数量,按比例适当放大体积。如果酶切反应总体积太大,使 DNA 浓度与限制酶浓度稀释,分子之间 难以接触,酶切效果就差,因而尽可能做到反应体积为最小。但是,酶切反应混合物中甘油的含量 不能超过 5%,否则将会抑制酶的活性(通常将酶量控制在反应总体积的 1/10 以下)。当使用的限制 酶活性不高时,必须加大限制酶的用量。这时为了酶的用量体积不超过反应总体积的 10%,其酶切 7 反应体积不可能保持到最小。另外,由于我们提取到的 DNA,大多都是保存在 TE 缓冲液中。如果 DNA 浓度很稀,加入反应系统中的体积要增大,这时 TE 中的 EDTA 将会与酶的激活因子螯合,影 响酶切效果。为此,也不得不放大反应体积或者将 DNA 重新浓缩。
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双酶切时需要注意以下几点: (1)如果所用两种酶的反应条件完全相同(温度、盐离子浓度等) 那么,可以将它们同时加到一个试管中进行酶切。 (2)如果所用的两种酶对温度要求不同,那么要 求低温的酶先消化,要求高温度的酶后消化,即在第一个反应结束后,加入第二个酶,升高温度后 继续进行酶切。 (3)如果两种酶对盐离子浓度要求不同,则要求低盐的酶先消化,要求高盐的酶后 消化,具体方法是:在低盐缓冲液中加入第一个酶,反应结束后,补加 1/10 体积的高盐缓冲液,加 入第二个酶再消化,或第一个反应结束后抽提 DNA,再用高盐缓冲液酶切。目前,各试剂商都提供 了双酶切缓冲液或通用缓冲液,可以根据说明书进行操作。

(二)酶切鉴定重组质粒
当空质粒载体的多克隆位点插入外源 DNA 片断后, 可以利用插入两端的限制性内切酶进行酶切 对外源片断的重组进行鉴定。如果插入外源片断,两种酶的单酶切将会产生比空质粒大的片段,在 电泳上表现为滞后片断。进行双酶切后将得到 2 条片断,一条和空质粒大小一致的片断令一条与插 入片断一样大。

实验内容
试剂与器材
试剂 (1)10×酶切缓冲液(购酶时随附) (2)EcoRⅠ酶;BamH I 酶。 (3)无菌水。 (4)质粒 pNTE-EGFP。 (5)琼脂糖。 (6)10mg/ml 溴乙锭溶液。 (7)DNA 分子量参照物(marker) 。 (8)50×TAE 电泳缓冲液。 (9)10×溴酚蓝上样缓冲液。 器材 (1)恒温水浴 (2)电泳槽 (3)电泳仪 (4)电炉 (5)紫外线检测仪 (6)移液器; 10-100μl,0.5-10μl

实验步骤
酶切
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(1)设计单酶切反应和双酶切反应。 (2)分别加入无菌水于 0.5m1 离心管中。 (3)分别加人 10×酶切缓冲液(反应总体积的 1/10)。 (4)分别加入 pNTE-EGFP 质粒 DNA。 (5)分别加入 EcoR I;BamH I 酶和 EcoR I+ BamH I 酶。酶量的加入通常是其活力的 5-10 倍.同时做一 个 pEGFPN3 质粒 DNA 的 EcoR I 单酶切。 例如: ddH2O 10×酶切缓冲液 DNA(1μg) EcoR I(或)BamH I 12μl 2μl 5μl 1μl 20μl ddH2O 10×酶切缓冲液 DNA(1μg) EcoR I BamH I 11μl 2μl 5μl 1μl 1μl 20μl (6)混匀,离心 5s。 (7) 37℃,1h。 (8)加入 3μl 10×溴酚蓝上样缓冲液混匀后进行 1%的琼脂糖凝胶电泳,成像观察。

电泳 (9)称取 1.0 g 琼脂糖,加入 100ml 1×TAE 电泳缓冲液中。 (10) 加热或沸水浴后使琼脂糖溶解。 (11) 凝胶冷至 60℃左右,加入溴乙锭至终浓度为 0.5μg/m1。 (12) 将琼脂糖溶液倒人模具,凝胶厚度一般为 0.3~0.5cm,检查有无气泡。室温下 15~30min 后,琼 脂糖溶液完全凝固。 (13) 连接电泳槽与电泳仪之间的电源线,正极为红色,负极为黑色。 (14) 取掉模具两端的胶布,放入电泳槽,加样孔在负极端。 (15) 加入 1×TAE 电泳缓冲液至电泳槽中,液面高于胶面 1mm,小心取出梳子。 (16) 在 DNA 样品中加入 1/10 的上样缓冲液并混匀。 (17) 用移液器将 DNA 样品加入梳孔中。电泳样品为:酶切样品;酶切前的对照样品;分子量参照物 (18)接通电源,DNA 样品往正极移动。电压选择为 3~5V/cm。注意:长度以两个电极之间的距离 计算。 (19)根据指示剂迁移的位臵,判断是否终止电泳;切断电源后,含 EB 的凝胶可以直接于紫外线灯下 观察结果或拍照记录。

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注意事项
1. 酶切反应的影响因素很多,操作时首先要保证质粒 DNA 的纯净,样品中过高的盐分和痕迹量的 酚等都会使酶切反应无法正常进行。 2. 酶切反应在冰上进行.严格控制内切酶的用量在总反应体积的 1/10,否则,甘油浓度过高会抑制酶 活性。不同的酶使用不同的反应液,注意相符合.双酶切时选择两种酶活性均较高的反应液,不能选择 合适的反应液时,先使用低盐反应液,加入相应的酶,然后补加一定的盐离子和对应的酶. 3. 尽可能地降低反应总体积,增大酶与底物间的碰撞机会,增加反应速度。 4. 倒胶时不能有气泡留在胶层中,电泳时注意去除模具两端的胶布和正负极的对接。

【思考题】 1. 2. 3. 4. 5. 什么是星号活性? DNA 的酶切实验要注意那些问题? 双酶切的缓冲液应满足什么条件?如何解决? 使用 EB 时应注意什么问题? 在做琼脂糖凝胶电泳时应注意什么问题?

【课外阅读】 大连宝生物公司限制性内切酶说明书. 美国 New England biolabs 公司说明书,网站:www.neb.com

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实验十 外源基因在大肠杆菌中的表达及其检测 实验目的
了解 IPTG 诱导的外源基因在大肠杆菌中的表达的原理,掌握外源基因在大肠杆菌中的表达及 其检测技术。

实验原理
将外源基因克隆在含有 lac 启动子的表达载体中, 让其在大肠杆菌中表达。 没有加入 IPTG 诱导 剂的时候,lacI 产生的阻遏蛋白与 lac 操纵基因结合,从而不能进行外源基因的转录和表达,而只 有表达载体随大肠杆菌的增殖和复制;当加入 IPTG 后,阻遏蛋白不能与操纵基因结合,则 DNA 外 源基因大量转录并高效表达。表达的蛋白可以通过 SDS-PAGE 进行初步鉴定。 不同的蛋白质分子具有不同的电荷和分子量。 蛋白质在强阴离子去污剂 SDS 与某一还原剂(如二 巯基乙醇)共同作用下并加热使蛋白质解离后, 变性的蛋白质与 SDS 结合并因此而带负电荷, 不同的 蛋白质结合 SDS 的量仅与分子量成正比而与氨基酸的序列无关,在 SDS-PAGE 电泳时,蛋白质在聚 丙烯酰胺中的迁移率仅仅取决于蛋白质的分子量。 聚丙烯酰胺凝胶电泳由丙烯酰胺单体和交联剂 N,N′—亚甲基双丙烯酰胺在催化剂作用下, 形成三维网状结构。 凝胶电泳不仅具有分辨不同分子量蛋白质的作用(即分子筛作用), 还具有浓缩作 用。由于不连续缓冲系统具有把样品中的 SDS-多肽复合物全部浓缩于极小体积的能力,从而提高了 分辨率。采用考马斯亮蓝快速染色,可及时观察电泳分离效果。

实验内容
材料:含有重组表达载体 pET-B1, 空表达载体 pET28b 的大肠杆菌 BL21。 试剂:细菌培养用的 LB 液体培养基, (含 50μg/ml 的卡那霉素)
LB 平板(含 50μg/ml 的卡那霉素) ,100mMIPTG, 10mg/ml 的溶菌酶(10mM Tris-HCl,pH8.0 配制) , SDS-PAGE 用试剂及考马斯亮蓝 R250 30%(W/V)凝胶贮存液(丙烯酰胺具有神经毒性,操作时要戴手套和口罩) 丙烯酰胺 29g,亚甲双丙烯酰胺 1g, 加 ddH2O 溶至 100ml,用新华 3 号滤纸过滤,棕色瓶中 4℃ 保存,每隔几个月须重新配制。 Tris-HCl,pH8.8 1.5mol/L

0.5mol/L Tris—HCl,pH 6.8。 10%SDS。 10%过硫酸铵(AP,新鲜配制)。
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TEMED(四甲基乙二胺)。 Tris-甘氨酸电泳缓冲液,pH8.3,可配成 5×贮存液备用,临用前稀释。 工作液 Tris 碱 甘氨酸 SDS 加 ddH2O 样品处理液
Deionized water 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 Glycerol 10% (w/v) SDS 2-mercaptoethanol 1% (w/v) bromophenol blue 3.8 ml 1.0 ml 0.8 ml 1.6 ml 0.4 ml 0.4 ml

5×贮存液 Tris 碱 甘氨酸 1%SDS 15.1g 94g 50ml 至 1000ml

25 mmol/L 250mmol/L (pH 8.3) 0.1%

染色液 0.4%考马斯亮蓝—R250 染色液。 甲醇 冰乙酸 考马斯亮蓝 R250 ddH2O 加至 脱色液 甲醇 冰乙酸 ddH2O 400ml 100ml 500ml 400m1 100ml 1g 1000m1

操作步骤
1 将冻存的含有组表达载体 pET-B1, 空表达载体 pET28b 的大肠杆菌 BL21 画线接种在 LB 平板上, 37 度培养过夜,直至平板上长出单菌落。 2 挑取单菌落至 5mlLB 液体培养基中,培养至 OD600=0.6 左右。4 度放臵过夜。 3 取 2ml 培养菌加入到 48ml 培养基中,继续培养至 OD600=0.4-0.6 之间。 4 表达载体和重组载体都分别设臵诱导组与不诱导组, 诱导组加入终浓度为 1mM 的 IPTG, 不诱 导组不加 IPTG。25 度诱导培养 12h。
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5 取 1.5ml 培养菌至离心管中,5000rpm 离心 1 分钟,收集细菌。 6 用 1ml 10mM Tris-HCl(pH8.0)悬浮细菌,5000rpm 离心 1 分钟,收集细菌。 7 加入 30ul 的 10mg/ml 的溶菌酶,充分悬浮,4 度放臵 2 小时以上。 8 制备 4%浓缩胶,12%的分离胶的 SDS-PAGE 胶。 按下表制备浓缩胶 水 30%丙烯酰胺溶液 0.5mol/L Tris-HCl pH 6.8 10%SDS 10%AP TEMED 6.1 1.33 2.5 0.1 0.05 0.01

按下表制备分离胶

9 超声处理 5 分钟,每 30 秒间隔 50 秒,12000rpm 离心 10 分钟,取上清作为蛋白样品。 10 渠 5ul 测定蛋白浓度。 11 取 50ug 蛋白上样,加入 5ul 上样缓冲液,沸水浴 5 分钟,瞬时离心后上样。 12 170V 恒压电泳至溴酚蓝至凝胶前沿。 13 染色 1 小时 14 脱色至条带清晰,背景明亮为止。

结果: 诱导的 pET-B1 菌液样品在分子量 61kDa 处有一明显的深厚条带,而其他三种处理没有
此条带。
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影响蛋白质电泳分离效果的因素
1.蛋白质样品中的盐浓度 影响蛋白条带的迁移率和带型,因此为消除盐浓度的影响,溶解 蛋白时最好用去离子水, 再加等量 2×SDS-PAGE 样品缓冲液, 必要时经过透析或进行 Sephader G25 过柱。 2.SDS 的质量 由于变性蛋白是与 SDS 结合而带负电荷,蛋白结合 SDS 的量与蛋白质的分子 量成正比,因此质量不同的 SDS,相同的蛋白质样品,将可能出现不同迁移率的电泳图谱。 3.上样孔是否平齐,若上样孔不平齐,也影响蛋白电泳的迁移率。 4.为防止相邻泳道样品的扩散,而导致电泳条带的不整齐,如有空臵的加样孔,须加等体积的 空白 1×SDS 样品缓冲液。

电泳样品的准备
1.浓度

29 9 单一成分 1—10μg,若浓度太稀,应沉淀后再进行电泳;对于非单一成分的样品,

如基因工程大肠杆菌的表达产物,其蛋白量 50~100μg 可取得较好的分离效果。 2.体积 样品体积尽可能小,以保证电泳条带的整齐,必要时可应用 6×SDS 加样缓冲液以增 加蛋白质的加样量。 3.盐浓度应尽可能低,可用 SephaderG25 快速脱盐;钾离子(K+)要除去,因为钾离子沉淀 SDS。 4.分离小分子肽时,分离胶的浓度可提高到 20%~25%。 5. 对照孔加入蛋白质分子量标准样品,同样也须 1000C 处理 3~5min。

注意事项
1. 丙烯酰胺单体和交联剂 N,N′—亚甲基双丙烯酰胺有神经毒性,在称量和配制时要带一次 性手套,称量时最好也戴上口罩。 2. 凝固后一般不再有毒性, 但考虑到存在没有完全交连的分子, 实验结束后不宜直接用手拿取, 要先用清水漂洗 5-10 分钟。 3. 室温较低时胶液不易凝固,可以在槽中加 370C 温水。 4. SDS 很容易漂浮在空气中而吸入体内,称量时最好在通风橱中进行,或戴上口罩。 5. 在实际操作中,很容易将电极接反,请注意,负极永远接在加样孔的一端(即上负下正) 。

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实验十一 RNA 的提取及其纯度检测 实验目的:
了解 Trizol 提取总 RNA 的原理,掌握高质量完整总 RNA 提取的技术以及电泳变性

胶电泳检测和浓度及纯度鉴定方法。

实验原理
Trizol 是一种酚与异硫氰胍的混合物,非常容易把组织和细胞中的总 RNA 提取出来。在加入氯 仿离心后,RNA 保留在水相中,与 DNA 和蛋白质分离开来(保留在有机相中) 。吸取水相,加入异 丙醇成淀 RNA,从而得到完整纯度高的总 RNA。

实验内容
材料 小鼠新鲜肝 试剂
总 RNA 提取纯化试剂:Trizol(Invitrogen);DEPC(Amersham),无水乙醇,已丙醇; 电泳试剂:MOPS,甲酰胺,甲醛,上样缓冲液(50%甘油,10 mM EDTA,0.25% 溴酚蓝,0.25% 二甲苯青) ,琼脂糖。

操作步骤 总 RNA 的提取
1 小鼠肝组织的匀浆裂解 断颈处死小鼠,立即解剖取出肝脏,取 50-100mg 到玻璃匀浆器中,假如 1mlTrizol 反复匀浆膜 碎组织,使细胞完全裂解。按 1 ml Trizol 加入 0.2 ml 氯仿,震荡 15 秒,室温放臵 3 分钟,12000×g, 4℃离心 15 分钟。 2 RNA 的沉淀 将离心的上清转移到新的离心管中,按 1 ml Trizol 加入 0.5ml 异丙醇,震荡 15 秒,室温放臵 10 分钟,12000×g,4℃离心 10 分钟。 3 RNA 的洗涤与溶解 吸掉上清,加入 1 ml 75% 乙醇洗涤沉淀,4℃,7500×g 离心 5 分钟。吸掉上清,空气干燥 RNA 沉淀 10 分钟,加入适量的 DEPC 处理水溶解 RNA,立即电泳和紫外浓度和纯度鉴定,剩余-20℃ 保存备用。

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在含有甲醛的凝胶上进行的 RNA 电泳
甲醛蒸气有毒,含有甲醛的溶液应在化学通风橱内配制,装有甲醛溶液的电泳槽应尽可能盖严。 1、配制 5×甲醛凝胶电泳缓冲液: 5×甲醛凝胶电泳缓冲液 0.1mol/L 40mmol/L 5mmol/L MOPS(pH7.O) 乙酸钠 EDTA(pH 8.O)

将 20.6g 3-(N-玛琳代)丙磺酸(MOPS)溶于 800ml 经用 DEPC 处理的 50mmol/L 乙酸钠溶液 (用 DEPC 处理溶液的方法见 344 页) 。用 2mol/L 氢氧化钠将溶液的 pH 值调至 7.0,加 10ml 经用 DEPC 处理的 0. 5mol/L EDTA(pH 8.0) 再加经用 DEPC 处理的水至溶液总体积为 1L.上述溶液经 , 用 0.2um 微孔滤膜过滤除菌,避光保存于室温。光照或高压后溶液逐渐变黄,淡黄色的缓冲液可 正常使用,而深黄色缓冲液则不然。

小心:DEPC 有致癌之嫌,须小心操作。
2、制备凝胶:将适量琼脂糖熔于水,冷却至 60℃,加入 5×甲醛凝胶电泳缓冲液和甲醛至终浓度 分别为 1×和 2.2mol/L(将 12.3mol/L 甲醛贮存液、琼脂糖水溶液和 5×甲醛凝胶电泳缓冲液 按 1:3.5:1.1 比例混合即可) 。在化学通凤橱内灌制凝胶。于室温放臵 30 分钟或更长时间,使凝 胶凝固。 甲醛 (分子量 30.03) 通常为 37%的水溶液 (12.3mol/L) 应确证这一浓溶液的 pH 值大于 4.0. , 3、 在一灭菌的微量离心管内混合下列液体,以制备样品: RNA(多达 30ug) 5x 甲醛凝胶电泳缓冲液 甲醛 甲酰胺 4ul 21ul 3.5ul 10.0ul

于 65 C 温育 15 分钟,冰浴冷却,离心 5 秒钟使管内所有液体集中于管底。 4、 加 2ul 灭菌的并经用 DEPC 处理的甲醛凝胶加样缓冲液。 甲醛凝胶加样缓冲液 50% 1mmol/L 0.25% 0.25% 甘油 EDTA(pH8.0) 溴酚蓝 二甲苯青 FF

5、加样前,将凝胶预电泳 5 分钟,电压降为 5V/cm,随后将样品加至凝胶加样孔。 6、将凝胶浸入 1×甲醛凝胶电泳缓冲液中,3-4V/cm 电压降进行电泳。 7、电泳结束后浸入溴化乙锭溶液(0.5ug/m1,用 0.1mol/L 乙酸铵配制)中染色 30-45 分钟。 与未变性的琼脂糖凝胶相比,含甲醛的凝胶较为脆弱,故应小心操作。
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结果 在凝胶上可以看到一般可以看到三条带,其中从上样孔开始对应的带的分别是 28S,18S 和 5S, 其中 18S 和 28S 的条带明显清晰,而 5S 的带比较弱,28S 的带的亮度是 18S 带亮度的 2 背左右, 说明 RNA 保持完整。 紫外分光光度法测定 RNA 的浓度和纯度 总 RNA 用 10mM 的 Tris-HCl(pH8.0)稀释,利用紫外分光光度计测定 A260 和 A280 值,根据 1OD=40ug 定量,并计算 A260/A280 比值,每一样品重复 3 次。 如果 A260/A280 比值均在 2.0 以上(2.0-2.2 之间) ,说明 RNA 的纯度很好。

注意事项
创造无 Rnase 的环境 注意以下几点,以防止 Rnase 污染样品,保证分离到全长 mRNA: 1、 手和空气中的细菌霉菌是主要的 Rnase 污染源。为防止污染,应在超净台上无菌操作。这些试 剂都要反复使用,所以开启和关闭试剂瓶一定防止污染。一直带塑料手套。 2、最好用一次性使用塑料制品提 RNA,这些制品常是无 RNase 的,无须灭活 RNase。 3、不是一次性使用的玻璃和塑料制品,用前应除 RNase。玻璃制品应于 200℃烘烤过夜,塑料制品 用前用 0.1N NaOH,1mM EDTA 作彻底冲洗,再用无 RNase 水冲洗。 4、用户自备的溶液应用 0.05%DEPC 处理过夜,再高压灭菌 30 分钟以出去痕量 DEPC。

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实验十二 逆转录 PCR(RT-PCR)扩增基因特异片段 实验目的 实验原理
PCR (Polymerase Chain Reaction; 聚合酶链式反应) 是一种体外扩增 DNA 的简单而有效的方法。 虽然原理上 PCR 法是扩增 DNA,RNA 不能直接被扩增,但是经过反转录酶的作用把 RNA 反转录 成 cDNA 后, PCR 法便可应用于 RNA 的解析了。 迄今为止, 此方法已广泛应用于 RNA 的构造解析、 cDNA 的克隆及 RNA 水平上的表达解析等多种领域。 编码蛋白质的基因在转录后形成 mRNA, mRNA 翻译后编码产生蛋白质。 真核生物的 mRNA 的 3 端有多个腺苷酸,形成寡聚腺苷酸的尾巴,因此可以与 Oligo dT 结合,在反转录的作用下形成 cDNA。再通过基因的特异引物 PCR 扩增得到基因的特异片段,此方法称为 2 步法。也可以根据已 知基因的序列设计引物,以基因的特异引物进行逆转录,得到特异基因的 cDNA,以此为摸板 PCR 扩增得到特异基因片段,由于此法转录和 PCR 扩增在同一反应管中进行,转录和扩增的引物相同, 因此称为一步法。 了解 RT-PCR 的原理,掌握 RT-PCR 扩增基因的特异片段的技术。

One Step RT-PCR 的原理 一步法的优点:

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实验内容
材料 小鼠新鲜肝 试剂 总 RNA 提取纯化试剂:Trizol(Invitrogen);DEPC(Amersham) 无水乙醇,已丙醇;
RT-PCR 试剂盒 TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV)(大连宝生物生物公司) 本试剂盒采用了一步反应法(One Step 法)完成 RT-PCR 反应。RNA→cDNA→PCR 反应操作 在 同 一 反 应 体 系 中 进 行 , 反 应 中 途 不 需 添 加 任 何 试 剂 , 就 可 以 完 成 由 AMV ( Avian Myeloblastosis Virus) 由来的反转录酶从 RNA 反转录为 cDNA, 再由 AMV-Optimized Taq 扩增 cDNA 的全部反应。本试剂盒中含有进行 One Step 法 RT-PCR 反应用的全部试剂,可以简便 而有效地对 RNA 进行扩增分析。

本试剂盒中的 Control RNA 是以 pSPTet3 质粒(质粒中的 SP6 启动子下游插入长约 1.4 kbp 的 pBR322 来源的 DNA 片段,其 DNA 片段上含有抗四环素基因)为模板由 SP6 RNA 聚合酶经

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体外转录而得到的。Control RNA(约 1.4 kb)是带有 30 个 A 碱基的具有 Poly(A)+尾的 RNA。 当把 Control RNA 经 RT-PCR 合成的双链 cDNA 插入质粒时,该质粒便可获得四环素抗性。

操作步骤
1 总 RNA 的提取根据上次实验总 RNA 的提取进行。

2 按下列组成配制 RT-PCR 反应液。

3 按以下条件进行 RT-PCR 反应。

当 RNA 为 Positive Control RNA 时,反应条件如下。

4 反应结束后,取 PCR 反应液 (5 –10ul) 进行 1%琼脂糖凝胶电泳,确认 RT-PCR 反应产物。 如果此 PCR 产物需用于以后实验,应将 PCR 产物冷冻保存。 Control 反应时扩增片段大小为 462 bp。

思考题 一步法和两步法 RT-PCR 的有何差别,在实际应用上体现在哪些方面?

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实验十三 实验目的

DNA 探针制备

了解双链 DNA 的缺口平移和随机引物标记法的原理以及掌握其技术。

实验原理
在基因分析的杂交方法中几乎都用到同位素或非同位素标记的探针。 制备探针的方法有 DNA 缺 口平移标记、随机引物标记、DNA 末端标记、寡核苷酸末端标记、引物延伸法标记、RNA 探针标 记以及非同位素标记等。每一种标记方法有各自的特点和适用范围。

缺口平移标记法
原理 DNA 酶 I 是一种核酸内切酶,它可在 DNA 两条链上随机酶切形成缺口,缺口的 3'端 为 3'-OH。DNA 聚合酶 I 具有 5'→3'外切酶活性和依赖引物和模板的 5'→3'聚合酶活性。在 缺口上 DNA 聚合酶Ⅰ沿 5' →3' 将缺口端的 5' -单核苷酸切除, 同时将游离的 dNTP 加在缺口的 3' -OH 上, 结果使缺口沿 DNA 平移(Nick translation)。 如果添加的 dNTP 中含一种或几种[α-32P]dNTP, 那么双链 DNA 就带上很高比活度的放射性(108cpm/μg),掺入效率>65%。

随机引物标记法
原理 随机引物标记法 DNA 用量少(25ng),同位素掺入较高(60%左右),最高放射比活度超过 1×109cpm/μg。 随机引物结合于线性变性单链 DNA 模板的多个位点, Klenow 酶作用下进行 5' 在 →3'引物延伸反应,标记同位素的 dATP 就随此过程掺入,一般可合成 250—300 bp 的标记探针(模 板大于 500bp)。

实验内容
缺口平移标记法
材料 DNA 酶(DNaseI)、 DNA 聚合酶 I(Promega 公司试剂盒提供按一定比例混合的混合物)。 [α -32P]dATP、dGTP,dCTP,dTTP(各 300μmol/L);缺口平移缓冲液(10×),待标记 DNA 1μg,终 止液(0.5mol/LEDTA)。

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方法 (1)混合下列试剂: 试剂 dCTP、dGTP、dTTP 混合液各 30μmol/L 缺口平移缓冲液 10× DNA [α-32P]dATP(100mCi/ml) DNA 酶 I 和 DNA 聚合酶 I 混合液 ddH2O 总 计 体积 10μl 5μl 1μg 5μl 5μl 24μl 50μl

(2)15℃反应 60min。 (3)加 5μl 终止液终止反应。 (4)-20℃保存备用,如立即使用一般保存在 4℃或 0℃。

随机引物标记法
材料 Klenow 酶, 32P]dATP, [αdTTP, dGTP, dCTP, ×标记缓冲液(900mmol/L HEPES, 10 MgCl2 100mmol/L,pH6.6),待标记 DNA 25ng。 20 方法 9 (1)DNA(25ng 溶于 TE 或 H2O)95~100℃变性 2min,迅速臵冰浴中。 (2)加入下列试剂: 试剂 dCTP dGTP dTTP 混合液各 500μmol 标记 10×6μg [α-32P]dATP(100mCi/ml) Klenow 酶 ddH2O 总 计 体积 2μl 5μl 5μg 5μl 33μl 50μl

(3)室温反应 60min。 (4)95~100℃加热 2min 并臵冰浴以终止反应。

标记探针的纯化
1.沉淀法(适用于>18bp 的探针) (1)标记反应混合物(20μl)中加入 40μl 水。
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(2)加入 240μ1NH4Ac(5mol/L)混匀。 (3)加入 750μl 冰预冷的无水乙醇,0℃臵 30min。 (4)0℃12 000r/min 离心 20min 沉淀标记探针,弃上清。 (5)加入 500μl 75%乙醇,振荡后离心 5min(12 000r/min),弃上清,空气干燥。 (6)沉淀重溶于水中,备用。 2.柱层析法 (1)取 5ml 容积的玻璃或塑料吸管,管口用纤维填塞, (2)装 SephadexG-50 凝胶,3 倍柱体积的 STE 洗脱。 (3)标记的 DNA 探针上样,样品进入凝胶后,加 STE 液洗脱。 (4)分管收集流出液,每管 200μl,标记探针存在第一放射峰中,弃其余。 (5)合并第一峰数管洗脱液,体积过大可乙醇沉淀。

注意事项
1.缺口平移适用于双链 DNA(超螺旋,开环,线性)的标记,反应时间不宜超过 2h。随机引物 法适用于双链、单链 DNA 和 RNA 探针的标记,反应时间可长达 16h。 2.一般杂交可不经纯化。 3.由于高比活放射性会造成 DNA 链的破坏,探针以马上使用为宜。 4.由于缺口平移法标记中 DNA 酶 I 和 DNA 聚合酶 I 的比例十分重要,许多购买的试剂盒都已 按比例混合,不必再自行探索条件。

【思考题】 1 缺口平移的原理是什么?有什么用途? 2.随机引物法适于哪种样品的标记?

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实验十四 实验目的

Southern 印迹杂交

学习和掌握 Southern 印迹杂交技术,检测重组 DNA 分子中是否含有目的基因片段。

实验原理
具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下,可按碱基互补的原则形成双链,此杂交过程 是高度特异性的。 Southern 印迹杂交技术包括两个主要过程:一是将待测核酸分子通过一定的方法转移并结合到 一定的固相支持物(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上,即印迹(blotting);二是固定于膜上的核酸同同位素标 记的探针在一定的温度和离子强度下退火,即分子杂交过程。这种技术是 E.M.Southern l975 年首 创的,因此称 Southern 印迹杂交。 Southern 印迹的印迹方法有毛细管法、 电转法、 真空转移法, 滤膜有尼龙膜、 化学活化膜(如 ABM、 APT 纤维素膜)等。这里主要介绍目前常用的电转法。 电转法是利用电场的电泳作用将凝胶中的 DNA 转移到固相支持物上, 是近年来发展起来的一种 简单、迅速、高效的 DNA 转移法。一般只需 2~3h,对于用毛细管法不理想的大片段 DNA 的转移 较为适宜。常用的电转仪有铂金丝电极和石墨电极。

实验内容
材料和试剂
印迹试剂 l.待测样品,适当的限制性内切酶、琼脂糖。 2.变性液 1.5mol/L NaCl,0.5mol/LNaOH,高压灭菌。 3.中和液 1mol/L Tris〃HC1(pH8.0),1.5mol/L NaCl,高压灭菌。

4.电泳液和转移液 1×TBE 或 TAE。 5.尼龙膜、铂金丝电极电转仪。 杂交试剂 1.预杂交液 5×Denhardt 试液,50mmol/L 磷酸缓冲液(pH7.0),0.2%SDS,500μg/m1

变性的鲑精 DNA 片断,50%甲酰胺(也可不用)。

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2.20×SSC,3mol/L NaCl 0.3mol/L 柠檬酸钠。 3.2×SSC,0.1%SDS 溶液。 4.0.1×SSC,0.1%SDS 溶液。 5.0.1×SSC 溶液。 6.10mg/ml 小牛胸腺 DNA 溶液(或鲑鱼精 DNA 溶液)。 7.32P 标记的 DNA 探针。

操作步骤
电转移 1.取一定量的待测 DNA 样品,适当限制性内切酶酶切后,琼脂糖凝胶电泳。 2.电泳后溴化乙锭(EB)染色,长波紫外线观察电泳结果。 3.切去无用的凝胶部分,将凝胶浸泡于适量变性液中,轻轻摇动 1h。对于较大的 DNA 片断 (>15kb),可于变性前用 0.2mol/L HCI 预处理 10min 使脱嘌呤,再进行碱变性处理。 4.将疑胶用去离子水漂洗一次,然后浸泡于适量中和液 30min,轻轻摇动,重复一次。将凝胶 浸泡于 1×TBE 或 TAE 中。 5.裁剪 4 张同凝胶大小相同或稍大的 Whatman 3MM 滤纸,浸泡于 1×TBE 或 TAE 中,取 2 张臵于一海绵上。 6.裁剪一张同凝胶大小相同的尼龙膜,臵水中使其从底部向上浸润,然后臵于 1×TBE 或 TAE 中浸泡。 7.将充分湿润的尼龙膜覆盖于凝胶上,一端与加样孔对齐,注意排除二者间的气泡。 8.在尼龙膜上再覆盖两张润湿的 Whatman 3MM 滤纸,然后盖上另一张海绵。 9.海绵两侧夹上凝胶支持夹,臵于电转仪中,注意尼龙膜一侧臵于正极,凝胶一侧臵于负极。 10.300~600mA 恒流电泳,4~8h,循环水冷却。 11.电转完毕,尼龙膜用 1×TBE 或 TAE 漂洗,干燥滤纸吸干。 DNA 固定

尼龙膜可用短波紫外线照射几分钟,或者真空下 80℃烘烤 2h,以使 DNA 固定于尼 龙膜上。
放射性核素探针杂交 1.将上述固定了 DNA 的尼龙膜浸泡于 6×SSC 溶液 5min,充分湿润。 2.尼龙膜臵于一塑料袋中,加入适量预杂交液(0.2ml/cm2 膜面积),尽量排除其中气泡,用塑 料封口机封牢。 3. 恒温水浴中保温 2h, 当预杂交液加入了 50%甲酰胺时, 恒温 42℃, 不加甲酰胺时, 恒温 68℃。
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4.从水浴中取出塑料袋,去除部分预杂交液,加入单链 DNA 探针,排除气泡后,重新封好口。 5.根据退火条件选择合适的温度保温。一般在 45~68℃之间,视所用探针与待测核酸的同源 性大小而定,保温 16h 左右。 6.杂交完毕,取出塑料袋,弃去所有的杂交液,取出滤膜,迅速浸泡于 2×SSC 和 0.5%SDS 溶液中,室温下不断振荡,10min,重复一次。 7.将滤膜转至 2×SSC 和 0.1%SDS 溶液的容器中,室温下漂洗 15min。 8 滤膜转至 0.1×SSC 和 0.1%SDS 溶液中,65℃水浴振荡漂洗 30min,直到用检测器检不出信 号为止。 9.室温下,0.1×SSC 漂洗 5min,滤膜晾干后放射自显影。 放射自显影 1.将 Southern 膜臵于干净滤纸上,用含同位素的墨水在膜上作标记,以确定方位和检测放射自 显影的效率。 2.用塑料薄膜把 Southern 膜包好,上压一张 X 线片,两边附增感屏,夹于暗盒中;-70℃曝光, 24~48h 后洗片,本操作须在暗室中进行。

注意事项
1.电转法不能选用硝酸纤维素膜作为固相支持物,因为硝酸纤维素膜结合 DNA 依赖于高浓度 盐溶液,而高盐溶液导电性强,会产生强大电流使转移体系温度急剧升高,破坏缓冲体系,从而使 DNA 受到破坏。 2.如果用寡核苷酸探针或同源性较低的探针,杂交温度可适当降低,届时洗膜温度也要视情况 而定。

【思考题】
1. Southern 印迹杂交技术的基本原理是什么? 2. 你知道 Southern 印迹杂交技术在医学领域有哪些应用价值? 3. Southern 印迹杂交实验应注意哪些问题?

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实验十五 实验目的

Northern 印迹杂交

学习用标记探针杂交分析 RNA 样品中特定 mRNA 的大小及丰度。

实验原理
Northern 印迹杂交是 Southern 印迹杂交的基础之上发展而来的一种技术。 其基本原理是: RNA 将 样品通过琼脂糖凝胶进行分离,再转移到固相支持载体上,用同位素或生物素标记的探针对固定于 膜上的 mRNA 进行杂交,将具有阳性信号的位臵与标准分子量分子进行比较,可知此 mRNA 的分 子量大小,根据杂交信号的强弱进行比较,可知基因表达的丰度,因此这一技术广泛应用于基因的 表达调控、结构和功能研究。 Northern 印迹基本原理与 Southern 印迹类似,但 RNA 变性方法与 DNA 不同,不能用碱变性, 否则会引起 RNA 的水解。本实验以毛细管虹吸印迹法为例介绍 RNA 的转移过程,此方法稍加修改 后也可用于 Southern 印迹。RNA 膜转移完成后,杂交方法和一般核酸分子杂交类似。

实验内容
材料与试剂
1.待测细胞总 RNA 或 mRNA。 2.杂交探针 同位素 32P 或生物素标记。 3.5×甲醛凝胶缓冲液: 0.1 mol/L MOPS(pH 7.0) 40mmol/L 乙酸钠 5mmol/L EDTA(pH 8.0) 制备方法:20.6g MOPS 溶于 800ml 用 DEPC 处理过的 50mmol/L 乙酸钠溶液中,用 2mol/L NaOH 调节 pH 至 7.0,然后加入 10ml 0.5mol/L EDTA,用 DEPC 预处理过的蒸馏水调节体积至 1000ml,0.2μm 微孔滤膜过滤,室温下避光保存。 4.甲醛凝胶上样缓冲液: 1mmol/I EDTA(pH 8.0) 0.25% 溴酚蓝 0.25% 二甲苯青 DEPC 处理并高压灭菌,室温保存。 5. 100×Denhart's 溶液,20×SSC,等预杂交、杂交所用试液与 Southern 印迹相同。

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操作步骤
甲醛变性胶分离 RNA 样品 1.将适量琼脂糖加热溶于水,冷至 60℃,加入 5×甲醛胶电泳缓冲液和甲醛,使其终浓度分别 31 为 1×和 2.2mol/L,在化学通风橱内灌制凝胶(电泳槽必须彻底冲洗干净)。 9 2.取 1 个 Eppendorf 管,按以下体积配制样品: 4.5μ1 RNA(总 RNA30μg,mRNA0.3~3μg) 2.0μ1 5×电泳缓冲液

3.5μ1 甲醛 10.0μ1 甲酰胺 臵 65℃保温 15min,迅速臵冰浴中,稍稍离心。 3.加入 2μ1 上样缓冲液。 4.上样前凝胶预电泳 5min,然后将 RNA 样品立即上样于加样孔中,另一加样孔加入标准分子 量参照物(常用 28SrRNA 和 18SrRNA)。 5.在 1×甲醛胶电泳缓冲液中电泳,恒压 3~4V/cm,每 1~2h 将阴、阳极电泳缓冲液混合一 次。 6.电泳结束后,切下分子量标准参照物条带,溴化乙锭染色,紫外线下观察,照相。 Northern 印迹 1.上述电泳后的凝胶一般不需进行处理即可直接进行印迹。含有甲醛的凝胶可用 DEPC 预处 理过的水漂洗以去除所含的甲醛。如果凝胶较浓(大于 1%)、较厚(如大于 0.5cm)或待测 RNA 片段较 大(大于 2.5kb),可预先将凝胶臵 0.05mol/L NaOH 溶液中浸泡 20min,然后用 DEPC 处理过的水漂 洗,最后用 20×SSC 浸泡 45min。 2.切除无用的凝胶部分。将凝胶的左下角切去,以便于定位。然后将凝胶臵于一搪瓷盆中。 3.在一塑料或玻璃平台上铺上一层 Whatman 3MM 滤纸,此平台要求比凝胶稍大。将此平台臵 于一盛有 20×SSC 的搪瓷盆中。滤纸的两端要完全浸泡在溶液中。将滤纸用上述溶液浸润,用一玻 璃棒将滤纸推平,并排除滤纸与玻璃之间的气泡。 4.裁剪下一块与凝胶大小相同或稍大的硝酸纤维素膜。注意操作时要戴手套,注意不可用手触 摸滤膜,否则油腻的膜将不能被湿润,也不能结合 RNA。 5.将硝酸纤维素漂浮在去离子水中,使其从底部完全湿润。然后臵于 20×SSC 中至少 5min。 6.将中和后的凝胶上下颠倒后,臵于上述铺上了 Whartman 3MM 滤纸的平台中央。注意两者 之间不要有气泡。 7.在凝胶的四周用 Parafilm 封严,以防止在转移过程产生短路(转移液直接从容器中流向吸水 纸),从而使转移效率降低。 8.将湿润的硝酸纤维素膜小心覆盖在凝胶上,膜的一端与凝胶的加样孔对齐,排除两者之间的
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气泡。 相应地将膜的左下角剪去。 注意膜一经与凝胶接触即不可再移动, 因为从接触的一刻起, RNA 已开始转移。 9.将两张预先用 2×SSC 湿润过的与硝酸纤维素膜大小相同的 Whatman 3MM 滤纸覆盖在硝酸 纤维素膜上,排除气泡。 10.裁剪一些与硝酸纤维素膜大小相同或稍小的吸水纸,厚 5~8cm。将之臵于 Whatman 3MM 32 滤纸之上。在吸水纸之上臵一玻璃板,其上压一重约 500g 的物体。转移液将在吸水纸的虹吸作用下 9 从容器中转移到吸水纸中,从而带动 RNA 从凝胶中转移到硝酸纤维素膜上。 11.静臵 6~18h 使其充分转移,其间换吸水纸 1~2 次。 12.弃去吸水纸和滤纸,将凝胶和硝酸纤维素膜臵于一干燥的滤纸上。用软铅笔或圆珠笔标明 加样孔的位臵。 13.凝胶用溴化乙锭染色后紫外线下检查转移的效率。硝酸纤维素膜浸泡 6×SSC 溶液中 5min 以去除琼脂糖碎块。 14.硝酸纤维素膜用滤纸吸干。然后臵于两层干燥的滤纸中,真空下 800C 烘烤 2h。 15.此硝酸纤维素膜即可用于下一步的杂交反应。如果不马上使用,可用铝箔包好,室温下臵 真空中保存备用。 16.对于聚乙二醛电泳的 RNA,在杂交前必须在 65℃下用 20mmol/L Tris〃CI(pH8.0)溶液清 洗,以去除聚乙二醛分子。 滤膜杂交 预杂交、杂交过程同 Southern 印迹。 放射自显影 取出漂洗后的尼龙膜,用保鲜膜包裹。RNA 面朝上,臵于暗盒中,将一块比杂交膜稍大的 X 光 片压在保鲜膜上。-20℃,黑暗下放射自显影。一段时间(2 周后)取出 X 光片依次进行显影、停影 和定影,最后用自来水、双蒸水冲洗后晾干。

注意事项
1.RNA 极易被环境存在的 RNA 酶降解,因此应特别注意。 2.本实验叙述的转膜方法也基本适用于尼龙膜。另外,尼龙膜在碱性条件下与 RNA 结合,因此 可用 7.5mmol/L NaOH 作为转移液,转移效率会更高。

【思考题】
1. Northern 印迹杂交的基本原理是什么?与 Southern 印迹杂交有何联系与区别?

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实验十六 荧光原位杂交(FISH)技术

实验目的
了解荧光原位杂交的基本原理,掌握其操作技术。

实验原理
荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术是建立在核酸分子杂交和放射性 原位杂交基础上发展起来的非放射性原位杂交技术,将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行 杂交,融和了细胞生物学与分子生物学的技术,实际上是分子生物学与细胞生物学交叉结合而形成 的一种现代生物技术, 属于分子细胞生物学的范畴。 它是基于 DNA 探针序列与标本细胞中互补序列 的特异碱基配对的原理。DNA 探针经引入报道分子(如生物素或地高辛)的化学修饰后,可利用与 特异报道分子结合物(如亲和素或直接抗报道分子的抗体)偶联的荧光染料加以检测。FISH 技术可 用于染色体的 DNA 检测、基因定位、转基因检测、染色体异常观测及疾病的诊断等众多领域。FISH 技术现已成为分子生物学与分子细胞遗传学研究中的重要手段。而且,随着分子生物学技术的发展, FISH 技术也在不断发展和进步,其应用领域还在不断扩展和延伸。

实验内容
FISH 的基本步骤 1.制备标本 任何形式的组织、细胞、间期及中期染色体,而在分子细胞遗传学领域中用得最
多的是分裂中期的染色体标本。

2.标记探针
(1)探针的种类 a.着丝粒探针(centromeric probe) 包含染色体着丝粒及近着丝粒区域的重复 DNA 序列。 可用于 中期染色体或间期核的 FISH,以检测染色体数目异常,也可用于间期核甚至染色质的高分辨 FISH 作图(fiber-FISH)分析。 b.全染色体或染色体区带特异性探针(whole chromosome or region-specific probe) 由整条染色体或其上某一区段的几段核酸片段组成。该探针既可通过流式细胞分离器分离染色 体,也可用微切 DNA 通过 PCR 获得。可用于中期染色体重组和间期核结构分析。 c 染色体特异性单一序列探针(unique sequence probe ,USP) 指染色体某一位点特异性 DNA 片段。可从探针池分离得到单拷贝;还可从 YAC、PAC、Cosmid 等分子克隆库中获得。可用于检测染色体微小重复和缺失,鉴定染色体易位断裂点等,也可用来进行 染色体克隆 DNA 序列定位和检测靶 DNA 拷贝数及结构变化。 38 d 端粒染色体探针(telomeric chromosome 9 probes)

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端粒是真核细胞染色体末端结构,是一种由许多重复序列-可能包括数百次(TTAGGG)核苷酸 重复及相关蛋白组成的复合体。 国外已开发出了可识别各个端粒的特异性端粒 DNA 探针。 端粒探针 为人类提供了过去所不能解决的检测患者的微小易位和缺失的手段。 (2)标记的方法 ①直接法 ②间接法 A.缺口平移法 B.随机引物延伸法

3.变性和杂交 4.检测和显色

四、FISH 的实验流程:
标本的制备 探针的制备

标本预处理

探针的标记

变性处理

变性处理





荧光显微镜 观 察

五、FISH 具体步骤: (一)、染色体标本制作
样本材料前处理后,采用下面的方法制片: 1. 石蜡切片法:包埋 切片 染色 水洗 干燥 2. 压片法:将样本材料臵于洁净载玻片中央 滴上醋酸洋红或醋酸地衣红染色 15ˊ压片,吸取 39 9 多余染色液 显微镜观察 摄影 分析 3. 涂片法:将样本材料臵于洁净载玻片中央,吸取固定液 I(3 无水乙醇:3 冰乙酸:4 蒸馏水) ,
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沿倾斜玻片滴于样本组织上方,平放玻片再滴 1-2 滴固定液 I,待固定液 I 快干时,用解剖针刺破、 切碎样本组织并迅速均匀地涂片; 其后于细胞涂片中央滴加固定液 II (1 无水乙醇:1 冰乙酸)1-2 滴, 待即干时滴加固定液 III(冰乙酸原液)1-2 滴,自然风干后保存。 4. 空气干燥法(滴片法) :将样本组织材料离心(800—1000rpm,15ˊ) ,加入卡诺氏固定液(甲 醇或无水乙醇:冰乙酸=3:1),用滴管打匀后固定 30ˊ;离心(800-1000rpm)15ˊ,去掉上清液,加入 新鲜卡诺氏固定液,用滴管打匀后固定 30ˊ;离心(800-1000rpm)15ˊ,去掉上清液,加入新鲜卡 诺氏固定液,用滴管打匀后固定 30ˊ;离心(800-1000rpm)15ˊ。如此反复 3-4 次,最后去掉上清 液,加入适量的新鲜卡诺氏固定液(保证细胞浓度适宜)打匀,进行滴片,干燥保存

(二) 、探针制备
提取含探针基因 DNA 片段的质粒 DNA,并经 PEG 纯化后,用随机引物法进行标记,混匀后瞬 时离心,臵 37℃恒温箱过夜;加 EDTA 终止反应。探针纯化按如下步骤进行:在标记好的探针溶液 中加入 2.5μL 4mmol/L LiCl 和 75μL 预冷(-20℃)乙醇,混匀;臵-70℃,30min 后取出 12000rpm 离心 15 分钟;小心弃去上清液后加入 50μL70%冰乙醇洗涤沉淀;真空干燥 DNA;加 20~50μL TE 溶解 DNA,存于-20℃冰箱备用。

(三) 标记效率测定 、
参照说明书进行。经免疫显色检测,并同已稀释好的 DIG 标记 DNA 的对照条(标准)进行比 较。

(四) 、荧光原位杂交
每张染色体标本经 2×SSC 的 600μL RNase A 处理后, 用系列乙醇脱水, 再用蛋白酶 K 处理后, 于 70℃ 70%甲酰胺/2×SSC 中变性 3 分钟,立即臵冰乙醇系列中各 5 分钟。干燥后,将 50μL 经 100℃沸水浴变性 7 分钟后的鲜配杂交混合液滴于玻片上。杂交标本盖上玻片后,最后臵潮湿杂交盒 中 37℃杂交过夜。

(五) 、免疫荧光检测
杂交后的标本于 37℃依次经 50%甲酰胺/2×SSC 2 次,每次 3 分钟,2×SSC 2 次,每次 3 分 钟及 4×SSC 1 次 5 分钟洗涤后,用 50μL 4×SSC / 3%BSA/0.1%Tween 20/10mmol/L MgSO4 封阻 15 分钟,加 50μL Anti-DIG-Fab- Fluorescin (2μg/mL)于 37℃温育 45 分钟,经 4×SSC/0.1%Tween 20/10mmol/L MgSO4 室温振荡冲洗 3 次,每次 3 分钟。玻片用 PI 和 DAPI 复染 15 分钟,加 50μL 抗荧光猝灭剂后用指甲油封片,在荧光显微镜下,观察寻找杂交信号,并用 Kodak(ppc400-1600) 彩色胶卷照相。

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实验十七 外源基因在哺乳细胞中的表达及其检测 实验目的
掌握真核细胞的培养,细胞转染以及 western blot 技术检测外源基因在哺乳细胞中的表达。

实验原理
哺乳动物细胞作为宿主表达系统具有许多优点: (1) 该体系能识别和除去外源基因的内含子,剪接加工成熟的 mRNA。 (2) 能对翻译后的蛋白质进行加工修饰,使表达产物具有生物活性。 (3) 用作受体的哺乳动物细胞易被重组 DNA 转染,其有遗传稳定性和可重复性。 哺乳动物基因转移载体都附有标记基因, 以便于转染外源基因的细胞的筛选。 外源 DNA 导入真 核细胞的方法,常用的由磷酸钙转染法,电穿孔转染,脂质体包裹转染,显微注射及 DEAE-葡聚 糖转染技术。基因表达产物的检测可采用免疫荧光抗体,免疫沉淀及免疫印迹等方法进行。

实验内容
材料
质粒: pNTE-EGFP( 增强型绿色荧光蛋白标签的 NTE 全长表达载体)pEGFP-N3(Clontech) ; 哺乳动物细胞 COS7

试剂
细胞培养试剂:DMEM (Gibco);胎牛血清(Hyclone) 抗生素:氨苄青霉素钠盐,硫酸链霉素(Sigma) G418(Gibco) ; 细胞转染试剂:Lipofectamine 2000 (Invitrogen);Opti-MEM I 培养基(Gibco) DNA 纯化试剂盒:Endofree Plasmid Maxi Kit,Plasmid Midi Kit(Qiagen) Western 试剂:抗体:BD Living Colors A. v. monoclonal antibody (JL-8) (BD Biosciences, Clontech); Anti-mouse IgG (Fc specific) peroxidase conjugate,Monoclonal anti-HA clone HA-7 (Sigma);人 杂交膜 Hybond ECL (Amersham) ECL 底物: ; Supersignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce); X 光片(柯达公司)

操作步骤
细胞的培养 COS7 细胞在含有 10%胎牛血清的 DMEM,5%CO2,饱和湿度下培养。 转染用 DNA 的纯化 按照 Qiagen 试剂盒说明书进行,测定 DNA 的浓度和纯度。 细胞的转染 转染前一天, 接种细胞到无任何抗生素的 DMEM 培养基的 6 孔细胞培养板中, 使细胞密度

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保持在 90%饱和度。 将 4 ?g DNA 和 10 ?l 转染试剂 Lipofectamine 2000 分别溶于 250 ?l 无抗生素和血清的 opti-MEMI 培养基中,温和混匀,室温放臵 5 分钟。 将稀释的 DNA 和转染试剂温和混匀,室温孵育 20 分钟。 将 DNA 和转染试剂的混合物加入到 2 ml 无抗生素的 DMEM 培养基中,前后来回摇晃混匀后, 37℃培养 48 小时,直接进行蛋白的表达检测。

检测方法一:显微观察 由于表达的基因是与绿色荧光蛋白想欧联的, 因此可以在转染 48h 后直接在荧光显微镜下观察, 如果细胞发出绿色荧光,说明外源基因在其中表达。

检测方法二:Western blotting
细胞蛋白的提取和定量 转染后的培养细胞在吸去培养基之后,用胰酶消化经离心后收集细胞。用 PBS 漂洗 2 遍后,离 心收集细胞, 加入一定量的细胞总蛋白裂解液 (20 mM MOPS, 0.15 M NaCl, 1% NP-40, 1% 去 氧胆酸钠,1 mM EDTA,1% SDS) 。在加入裂解液和蛋白酶抑制剂(1 mM PMSF、10 ?g/ml Aprotinin、2 ?g/ml Leupetin、2 ?g/ml Benzamodine)之后,充分悬浮细胞,冰上超声破碎细胞, 12000g 离心 10 分钟,取上清作为细胞蛋白提取物,用 Lowry 法测定蛋白浓度。 蛋白质的 SDS-PAGE 等量的蛋白(40 ?g)在加入上样缓冲液充分混匀后,沸水浴煮 5 分钟,瞬时离心后进行 SDS-PAGE。 蛋白印迹 将电泳后的蛋白胶在转移液(3.03 g Tris,14.4 g Glycine,200ml Methanol/L)中浸泡至少 20 分 钟;Hybond ECL 膜在双蒸水中浸湿后,在转移液中平衡至少 10 分钟。半干转移法(BIO-RAD)转 移 3 小时。 封阻和杂交 将印迹后的蛋白膜在封阻液(含 5% 脱脂奶粉和 0.1%(V/V)Tween-20 的 PBS ,pH 7.5)中 室温下封阻至少一小时。用洗液(含 0.1%(V/V)Tween-20 的 PBS)稍洗两次后,再洗 15 分钟,1 次;5 分钟,2 次。加入适量稀释的一抗,在 4℃孵育杂交过夜。杂交后按照上述洗涤步骤洗膜。加 入按 1:1000 稀释的二抗(偶联有辣根过氧化物酶的抗小鼠 IgG 抗体) ,在室温下孵育杂交至少 1 小 时。按上述洗涤步骤洗膜。 化学发光曝光和显影 按 10 平方厘米 1 毫升检测液,等比例混合 ECL 检测液 A 和 B,滴加在膜的蛋白面,室温放臵 5 分钟,吸掉过多的检测液,用保鲜膜包裹膜(注意排除气泡) ,蛋白面朝上,黑暗下进行 X 光片曝 光,按显影—停影—定影步骤冲洗胶片。
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蛋白浓度测定(Lowry 检测法) 先配制溶液 A (100ml 含 0.5g CuSO4〃 2O, 柠檬酸) 5H 1g 和溶液 B 1L 含 20g 碳酸钠, 氢 ( 4g 氧化钠) 。用双蒸水稀释样品至 0.5 ml,然后加入 2.5 ml 溶液 C(1 体积溶液 A 和 50 体积溶液 B 的 混合物)混匀,在室温下放臵 5 分钟-10 分钟。接着加入 0.25 ml 溶液 D(等体积的 Folin-酚和双蒸 水的混合物) ,混匀。最后室温放臵 20 分钟-30 分钟后,在分光光度计上测 A750 值。 蛋白质浓度标准曲线的制作:以牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白,0、2.5、5、10、20、40、 80 ?g/ml 的浓度蛋白制作,每个浓度设定 3 个重复,取平均光吸收值作为纵轴,蛋白浓度为横轴, 绘制标准曲线。

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实验十八 生物芯片技术 一、生物芯片简介
生物芯片(biochip)是指采用光导原位合成或微量点样等方法,将大量生物大分子比如核酸片 段、多肽分子甚至组织切片、细胞等等生物样品有序地固化于支持物(如玻片、硅片、聚丙烯酰胺 凝胶、尼龙膜等载体)的表面,组成密集二维分子排列,然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂 交,通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机(CCD)对杂交信号的强度进行快速、 并行、高效地检测分析,从而判断样品中靶分子的数量。由于常用玻片/硅片作为固相支持物,且在 制备过程模拟计算机芯片的制备技术,所以称之为生物芯片技术。根据芯片上的固定的探针不同, 生物芯片包括基因(DNA)芯片、RNA 芯片、蛋白质芯片(包括抗体芯片)、细胞芯片、组织芯片, 另外根据原理还有元件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯片等新型生物芯片。如果芯 片上固定的是肽或蛋白, 则称为肽芯片或蛋白芯片; 如果芯片上固定的分子是寡核苷酸探针或 DNA, 就是 DNA 芯片。由于基因芯片(Genechip)这一专有名词已经被业界的领头羊 Affymetrix 公司注册 专利,因而其他厂家的同类产品通常称为 DNA 微阵列(DNA Microarray)。这类产品是目前最重要的 一种,有寡核苷酸芯片、cDNA 芯片和 Genomic 芯片之分,包括二种模式:一是将靶 DNA 固定于 支持物上,适合于大量不同靶 DNA 的分析,二是将大量探针分子固定于支持物上,适合于对同一靶 DNA 进行不同探针序列的分析。 生物芯片技术是 90 年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一,是融微电子学、生物学、物 理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术,具有重大的基础研究价值,又具有明显的产 业化前景。由于用该技术可以将极其大量的探针同时固定于支持物上,所以一次可以对大量的生物 分子进行检测分析,从而解决了传统核酸印迹杂交(Southern Blotting 和 Northern Blotting 等)技术 复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量(low through-put)等不足。而且,通过设计不同 的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值,如基因表达谱测定、突变 检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序(Sequencing by hybridization, SBH)等,为“后基因组 计划”时期基因功能的研究及现代医学科学及医学诊断学的发展提供了强有力的工具,将会使新基 因的发现、基因诊断、药物筛选、给药个性化等方面取得重大突破,为整个人类社会带来深刻广泛 的变革。该技术被评为 1998 年度世界十大科技进展之一。

二、应用领域
1. 基因表达水平的检测
用基因芯片进行的表达水平检测可自动、快速地检测出成千上万个基因的表达情况。Schena 等用人外周血淋巴细胞的 cDNA 文库构建一个代表 1046 个基因的 cDNA 微阵列,来检测体外培养 的 T 细胞对热休克反应后不同基因表达的差异,发现有 5 个基因在处理后存在非常明显的高表达, 11 个基因中度表达增加和 6 个基因表达明显抑制。 该结果还用荧光素交换标记对照和处理组及 RNA 印迹方法证实。在 HGP 完成之后,用于检测在不同生理、病理条件下的人类所有基因表达变化的 基因组芯片为期不远了。

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2. 基因诊断
从正常人的基因组中分离出 DNA 与 DNA 芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分 离出 DNA 与 DNA 芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱,就可以得出病变的 DNA 信息。这种基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点,将成为 一项现代化诊断新技术。例如 Affymetrix 公司,把 p53 基因全长序列和已知突变的探针集成在芯片 上,制成 p53 基因芯片,将在癌症早期诊断中发挥作用。又如,Heller 等构建了 96 个基因的 cDNA 微阵,用于检测分析风湿性关节炎(RA)相关的基因,以探讨 DNA 芯片在感染性疾病诊断方面的 应用。现在,肝炎病毒检测诊断芯片、结核杆菌耐药性检测芯片、多种恶性肿瘤相关病毒基因芯片 等一系列诊断芯片逐步开始进入市场。基因诊断是基因芯片中最具有商业化价值的应用。

3. 药物筛选
利用基因芯片分析用药前后机体的不同组织、 器官基因表达的差异。 如果再 cDNA 表达文库得 到的肽库制作肽芯片,则可以从众多的药物成分中筛选到起作用的部分物质。还有,利用 RNA、 单链 DNA 有很大的柔性,能形成复杂的空间结构,更有利与靶分子相结合,可将核酸库中的 RNA 或单链 DNA 固定在芯片上,然后与靶蛋白孵育,形成蛋白质-RNA 或蛋白质-DNA 复合物,可以筛 选特异的药物蛋白或核酸,因此芯片技术和 RNA 库的结合在药物筛选中将得到广泛应用。在寻找 HIV 药物中,Jellis 等用组合化学合成及 DNA 芯片技术筛选了 654536 种硫代磷酸八聚核苷酸,并 从中确定了具有 XXG4XX 样结构的抑制物,实验表明,这种筛选物对 HIV 感染细胞有明显阻断作 用。生物芯片技术使得药物筛选,靶基因鉴别和新药测试的速度大大提高,成本大大降低。

2. 个体化医疗
临床上,同样药物的剂量对病人甲有效可能对病人乙不起作用,而对病人丙则可能有副作用。 在药物疗效与副作用方面,病人的反应差异很大。这主要是由于病人遗传学上存在差异(单核苷酸 多态性,SNP),导致对药物产生不同的反应。如果利用基因芯片技术对患者先进行诊断,再开处 方, 就可对病人实施个体优化治疗。 另一方面, 在治疗中, 很多同种疾病的具体病因是因人而异的, 用药也应因人而异。例如乙肝有较多亚型,HBV 基因的多个位点如 S、P 及 C 基因区易发生变异。 若用乙肝病毒基因多态性检测芯片每隔一段时间就检测一次, 这对指导用药防止乙肝病毒耐药性很 有意义。

3. 测序
基因芯片利用固定探针与样品进行分子杂交产生的杂交图谱而排列出待测样品的序列, 这种测 定方法快速而具有十分诱人的前景。 Mark chee 等用含 135000 个寡核苷酸探针的阵列测定了全长为 16.6kb 的人线粒体基因组序列,准确率达 99%。Hacia 等用含有 48000 个寡核苷酸的高密度微阵列 分析了黑猩猩和人 BRCA1 基因序列差异, 结果发现在外显子 11 约 3.4kb 长度范围内的核酸序列同 源性在 98.2%到 83.5%之间,提示了二者在进化上的高度相似性。据未经证实的报道,去年有一种 不成熟的生物芯片在 15 分钟内完成了 1.6 万个碱基对的测定,96 个这样的生物芯片的平行工作, 就相当于每天 1.47 亿个碱基对的分析能力!

4.

生物信息学研究
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人类基因组计划(HGP)是人类为了认识自己而进行的一项伟大而影响深远的研究计划。目前 的问题是面对大量的基因或基因片断序列如何研究其功能, 只有知道其功能才能真正体现 HGP 计划 的价值--破译人类基因这部天书。后基因组计划、蛋白组计划、疾病基因组计划等概念就是为实现这 一目标而提出的。生物信息学将在其中扮演至关重要的角色。基因芯片技术就是为实现这一环节而 建立的,使对个体生物信息进行高速、并行采集和分析成为可能,必将成为未来生物信息学研究中 的一个重要信息采集和处理平台,成为基因组信息学研究的主要技术支撑。生物芯片作为生物信息 学的主要技术支撑和操作平台,其广阔的发展空间就不言而喻。 在实际应用方面,生物芯片技术可广泛应用于疾病诊断和治疗、药物基因组图谱、药物筛选、 中药物种鉴定、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督、环境检测、国防等许多领域。它将 为人类认识生命的起源、遗传、发育与进化、为人类疾病的诊断、治疗和防治开辟全新的途径,为 生物大分子的全新设计和药物开发中先导化合物的快速筛选和药物基因组学研究提供技术支撑平 台,这从我国 99 年 3 月国家科学技术部刚起草的《医药生物技术―十五‖及 2015 年规划》中便可见 一斑:规划所列十五个关键技术项目中,就有八个项目(基因组学技术、重大疾病相关基因的分离 和功能研究、基因药物工程、基因治疗技术、生物信息学技术、组合生物合成技术、新型诊断技术、 蛋白质组学和生物芯片技术)要使用生物芯片。生物芯片技术被单列作为一个专门项目进行规划。 总之,生物芯片技术在医学、生命科学、药业、农业、环境科学等凡与生命活动有关的领域中均具 有重大的应用前景。

二、生物芯片总流程图
芯片的准备 样品的准备

方法 1
直接购买 商品化芯 片(即用 型)

方法 2
自行设 计并向 厂家定 做芯片

方法 3
购买芯片 点样仪 购买/合成 Oligo/大规 模 PCR 扩增 目的片断 点样及固定 自制芯片

待测样品 核酸纯化

反转录标 记/PCR 标 记/随机 引物标记

探针制备 和标记

探针纯化





图像采集和分析
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实验十九

RNAi 技术

一、RNAi 的概念与产生的历史背景
随着分子生物学的飞速发展, 一些新分子生物学技术正在不断孕育和产生, RNAi 技术成为新的 分子生物学研究热点,独占分子生物学新技术的鳌头。 近年来研究表明,一些小的双链 RNA(dsRNA)可以高效、特异的阻断体内特定基因表达,促 使 mRNA 降解,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,即称为 RNA 干扰(RNA interference, RNAi, 也称 RNA 干预或干涉或沉默) 。其实,它是生物体内抵御外在感染的一种重要保护机制。由于可以 作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具。自 1998 年被发现以来,在其作用机制研究、应用 于生物基因组中特定基因功能的研究、封闭和阻断病原体基因表达等方面,取得了重要进展,显示 出良好的应用前景。 RNAi 技术正在功能基因组学领域掀起一场真正的深刻革命,并将彻底改变这个领域的研究步 伐。为此, 《Science》杂志和美国科学促进会将 RNAi 技术评为 2002 年度最重大的十大科学成就之 首,成为 2002 年度最耀眼的明星,是生物医学领域近 20 年来,可与 HGP 相提并论的最重大成果之 一。认为该项技术将对治疗肿瘤、爱滋病、肝炎等多种威胁人类健康的重大疾病带来希望。

二、RNAi 的作用机理
RNAi 最主要的作用是一小段(大约 21-23bp)的双链 RNA 分子(double-strainded
RNA,dsRNA ) 它 介 导 细 胞 内 序 列 特 异 性 基 因 表 达 阻 断 或 封 闭 , 也 就 是 转 录 后 基 因 沉 默 (post-transcriptional gene silencing, PTGS),从而起到控制细胞的各种高级生命活动。

1. RNAi 的作用水平
RNAi 是在多重水平上发挥作用的。最先在华丽新小杆线虫中发现,dsRNA 所诱导的基因沉默 在转录后水平,因为 dsRNA 导致了相应 RNA(mRNA)的降解,而基因启动子和内含子序列作为 基因沉默触发物则无效。后来在植物中也发现,RNAi 引起的基因沉默也是在转录后水平。 除此转录后水平降解 mRNA 的机制外,RNAi 还通过其他机制来影响基因表达。在植物中, dsRNA 导致基因组中与沉默触发物同源序列的甲基化;如果与沉默触发物与启动子序列相同,则引 起转录水平的基因沉默 。而另外的研究还发现,在华丽新小杆线虫中,RNAi 装臵中,内源性编码 的诱导剂,是在蛋白质合成水平发挥作用的。

2. RNAi 的作用的基本过程
第一步:起始步 沉默触发物被裂解,产生小干扰性 RNA(small interfering RNAs,siRNAs) 。 研究表明, 果蝇胚胎提取物就有将长链 dsRNA 底物裂解为长度在约 22bp 小片段的活性。 这些 siRNAs 是双链的,有磷酸化的 5ˊ端。这一过程,可能与 Rnase Ⅲ家族的功能有关。该家族中有一类已被 命名为 Dicer 酶,含 2 个催化结构域、1 个螺旋酶结构域和 1 个 PAZ 基序。遗传学研究表明,Dicer 酶结构在多种生物体之间比较保守。 第二步:效应步 siRNAs 与多种亚单位形成复合物—RNA 诱导的沉默复合物(RISC) ,然后以

RISC 的方式降解单链的靶 mRNA。在 RISC 中,这种大小约 22bp 的 siRNAs 所起的作用,是以碱基 44 配对的原则,识别与 dsRNA 相同序列的靶 mRNA,引导复合物中的 RNA 降解酶 RNase,确保对特 9 定的序列的靶 mRNA 进行降解。
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第三步:沉默效应的放大和扩散

在华丽新小杆线虫中,RNAi 能够扩散到整个虫体,即使只有

少量的触发物 dsRNA;在植物中也发现了相似的情况,沉默效应扩散到整株植物,并可转移到嫁接 的幼芽。研究发现,西红柿中 RNA 指导的 RNA 聚合酶(RdRP)与 RNAi 的扩散有关;而华丽新小 杆线虫和植物中 dsRNA 诱导的基因沉默所需要参与的蛋白质, 在序列上与西红柿的这种 RdRP 很相 似;在其他生物体中,起 RdRP 作用的分别可能是:拟南芥属—SDE1/SGS2,脉孢菌属—QDE-1, 胚系华丽新小杆线虫—EGO-1,华丽新小杆线虫成虫—RRF-1/RDE-9;而病毒诱导的基因沉默 (VIGS) ,则是螺旋酶。有学者认为,沉默效应的放大和扩散,是 RdRP 激发了另外的 dsRNA 合成。

RNAi 原理示意图

三、 RNAi 抑制病毒研究技术路线图
培养细胞 病毒转染 转染后的细胞 合成与靶基因 相对应的小段dsRNA 转染重组载体细胞 生物素或 DIG标记 探针制备 Southern Blot PCR检测染色质 与染色体观察 Southern Blot、PCR 检测染色质与染色体观 察组织切片、病理检测 转染重组载体小鼠 构建重组载体 实验小鼠 病毒转染 感染病毒的小鼠

FISH

综合比较分析

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实验二十 蛋白质组技术 一、研究材料
1995 年,Wasinger 等在第一篇蛋白质组研究文章中研究的对象为目前已知最小但能自主复制的 原核微生物——支原体 Mycoplasma genitalium。1996 年,研究对象即扩展到单细胞真核生物——酵 母以及人体正常组织及病理标本[28],进而突破了早期人们普遍认为的“蛋白质组研究只适用于基因 组计划已完成的生物”的界限。因此,1997 年,研究对象一下扩展到 14 种生物,其中虽然绝大多 数为原核生物,但也包含多细胞真核生物如线虫。近 4 年来,蛋白质组研究对象已无任何限制:无 需基因组计划完成(当然完成者更好),无原核生物/真核生物、单细胞/多细胞、组织之分。

二、研究范围
“蛋白质组”不仅其研究已成为具有重大战略意义的科学命题,而且其分析已成为一种十分有效 且应用广泛的研究手段。正因如此,蛋白质组的研究与分析其范围在短时间内即扩展到令人惊诧的 程度。据不完全统计,目前至少已涉及如下方面:①蛋白质,如蛋白质组作图、蛋白质组成分鉴定、 蛋白质组数据库构建、新型蛋白质发掘、蛋白质差异显示、同工体(isoform)比较;②基因,如功能 基因组计划、基因产物识别,基因功能鉴定、基因调控机制分析;③重要生命活动的分子机制,包 括细胞周期、细胞分化与发育、肿瘤发生与发展、环境反应与调节、物种进化等;④医药靶分子寻 找与分析,靶分子类型包括新型药物靶分子、肿瘤恶性标志、人体病理介导分子、病原菌毒性成分。 由此不难看到, “蛋白质组”研究与分析已涉足生命科学中一系列热点领域。 蛋白质组作图是早期蛋白组研究的主要领域。经过最初三年的努力,在 1995 年已测定 10 种蛋 白质组图(2-DE)的基础上,又测定了 11 种生物或组织的蛋白质组图,其中 3 种生物(线虫、豆科植物 根瘤菌属、 Ochrobactrum anthropi)蛋白质组图超过 1600 点,3 种蛋白质组图(大肠杆菌、盘基网柄菌、 人正常组织与病理组织)建立数据库并上互联网;各类生物中第一个完整的蛋白质组数据库(YPD)完 成,含 6021 种蛋白;提出“蛋白差异显示”概念,并用于环境应激、基因突变、病理进程等研究; 建立“proteomic contig’方法,进而使蛋白质组图分辨率提高 10 倍;提出“蛋白连锁图” (proteinlinkagemap)概念,改进双杂交系统,用于蛋白质组相互作用网络的分析;联合液体自动取样 器与 LC/ES-MS 技术,使蛋白质鉴定速度达 20 点/日;建立 2-DE 中糖蛋白与膜蛋白微量鉴定方 法;建立“Streamlined 样品处理”胶转膜技术,突破了大规模蛋白测序与氨基酸组成分析这两个严 重影响蛋白质组分析中蛋白质鉴定的限速步。

蛋白质组技术
三、研究技术

2D-Electrophoresis

Mass spectrometry
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Bioinformatics

(一)双向电泳的基本步骤
1、样品制备 大体包括蛋白质的溶解、变性及还原、去除非蛋白质杂质等。 目前,第一相等电聚焦大多采用 Amersham pharmacia Biotech 公司的

2、 第一相等电聚焦

IPGphor 或 Bio-Rad 公司的仪器。 通常采用的胶条厚度为 0.5mm, 3mm; 范围通常有 3-10、 宽 pH 4-7、6-11 几类,上样量可达毫克级。 3、第二相 SDS-PAGE 4、蛋白质的检测电泳后胶上蛋白质的检测有多种方法,灵敏度和分辨率有一些差异,可根据 上样量、分析要求等加以选择。 主要的方法有:染色法(考马斯亮兰染、银染、铜染) 、同位素标记、抗体标记、荧光标记(荧 光桔、荧光红等) 。

(二)不同 pH 分离范围的 IPG 干胶条
宽范围胶条 pH 3 – 10, 窄范围胶条 pH 4 – 7 , pH 6 – 11, pH 5 – 8 pH 3 – 12

甚至可以限定到一个 pH 单位

四、研究路线

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附录 基因工程基本技术路线

生物材料

mRNA

DNA

cDNA 文库

基因组文库

人工合成

目的基因

克隆载体

受体细胞

重组 DNA

克隆子

转基因生物

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